血管内皮生长因子表达与丹参预防肝小静脉闭塞病机制的研究

杨 丽，王向阳，徐晓平，陈 哲，朱洪怡，霍继荣

1.湖南省人民医院消化内科，湖南 长沙 410005； 2.长沙市中心医院老年科； 3.中南大学湘雅二医院消化内科

肝小静脉闭塞病(hepatic veno-occlusive disease，HVOD)又称肝窦阻塞综合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS)[1]。临床报道我国服用土三七致HVOD有增多趋势，HVOD发病机制尚不明确，治疗措施有限。本实验利用丹参干预土三七诱导的小鼠HVOD模型，研究HVOD发病机制并为HVOD治疗提供新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物雌性清洁级健康昆明小鼠(18～22 g)100只(由中南大学湘雅二医院动物实验室提供)，随机分为4组：A组(PBS对照组10只)；B组(土三七模型组30只)；C组(100 mg/kg丹参干预组30只)；D组(200 mg/kg丹参干预组30只)。各组动物体质量相比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 试剂及仪器PBS由中南大学湘雅二医院中心实验室提供，土三七购自安徽省毫州市药材鉴定公司中药公司，丹参购自哈药集团二产,VEGF一抗购自美国Abcam公司。

1.3 实验方法A组PBS 25 ml/kg灌胃；B组将100 g土三七熬成药液，相当于生药1 g/ml，30 ml/kg灌胃；C、D组将丹参粉针剂溶于质量浓度为9 g/L的生理盐水溶液，分别予100 mg/kg丹参+30 ml/kg土三七、200 mg/kg丹参+30 mg/kg土三七灌胃。各组小鼠连续灌胃30 d后处死。将新鲜肝脏取肝左叶4%甲醛固定，石蜡包埋，其余肝组织迅速标本放入液氮保存。

1.4 组织学检查新鲜肝脏组织4%甲醛固定，常规石蜡包埋后切片，行HE染色和Masson trichrome染色。肝脏病理光镜下评分标准根据Deleve修改后[2-3]光镜评分标准进行评分，包括中央静脉(CV)内皮损伤、肝细胞凝固性坏死、中央静脉内皮下出血、肝窦出血、中央静脉内皮下纤维化和中央静脉外膜纤维化共6项。各项根据累及范围、程度不同分别计分0～3分，累计各项计分，分为轻度(1～5分)、中度(6～8分)、重度(9～18分)。

1.5 免疫组化石蜡包埋组织，4 μm连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。3% H2O2封闭，再用质量浓度为50 g/L的牛血清白蛋白封闭，室温放置20 min后加一抗(VEGF兔多克隆抗体，Abcam公司，美国)40 μl，PBS稀释(VEGF 1∶1 000)，置于湿盒中4 ℃冰箱过夜，37 ℃恢复30 min。再加辣根过氧化物酶标记兔二抗(碧云天，中国)50 μl，置于湿盒中37 ℃ 30 min。DAB显色试剂盒对各组进行显色，步骤严格按试剂盒说明操作。染色结果判定：阳性结果判定：细胞胞浆或间质染成棕黄色，根据颜色的深浅，其阳性程度大致分为弱和强两个等级。各实验组随机选取3个或4个标本，显微镜下随机摄片10张，以图像分析软件IPP6.0(Image-Pro Plus 6.0)进行定量分析，所得累积光密度(integrated option density，IOD)的平均值即为该组小鼠的值，实验结果用Lg(IOD)值表示。

1.6 RT-PCR检测

1.6.1 引物设计：引物序列根据电脑软件Prmier 5.0版设计。上游序列：5′-GACCCTGGCTTTACTGCTGTA-3′,下游序列：5′-GTGAGGTTTGATCCGCATGAT-3′，扩增产物片段为303 bp。β-actin：上游序列:5′-ATGGATGACGATATCGCT-3′，下游序列:5′-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′，扩增产物片段为568 bp。

1.6.2 RNA提取和cDNA合成：取肝组织用Trizol法提取总RNA。提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳，可见28 s、18 s、5 s 3条带，无DNA污染条带，无明显降解条带，表明提取的总RNA纯度较高。取总RNA 1 μg，用逆转录说明书进行cDNA合成，-20 ℃保存。

1.6.3 目的基因的扩增：PCR扩增全序列，PCR反应条件：VEGF：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，72 ℃共延伸7 min。β-actin：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，72 ℃共延伸7 min。将反应产物取5 μl经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，紫外透射仪下观察结果，并在凝胶成像仪上照相。

2 结果

2.1 成模情况及病理组织学评分造模期间各组小鼠均有死亡现象，对照组死亡1只，土三七组死亡5只，100 mg/kg丹参干预组死亡4只，丹参200 mg/kg干预组死亡2只。对照组：根据HVOD诊断标准(Seattle标准[4]和Baltimore标准[5])和病理组织学检查，病理学评分平均值为0.10，无小鼠可诊断为HVOD。土三七组：根据HVOD诊断标准和病理组织学检查，土三七组有24只诊断为HVOD，其中5只出现大量腹水，根据Deleve修改后评分标准，病理学评分平均值为7.75，成模小鼠中25.0%(6/24)为轻度，45.8%(11/24)为中度，29.2%(7/24)为重度。100 mg/kg丹参干预组：仍有8只成模，未见小鼠出现腹水。根据Deleve修改后标准评分，成模小鼠中37.5%(3/8)为轻度，50.0%(4/8)为中度，12.5%(1/8)为重度。200 mg/kg丹参干预组：仅3只成模，未见小鼠出现腹水。根据Deleve修改后标准评分，成模的3只小鼠中33.3%(1/3)为轻度，66.7%(2/3)为中度，无重度HVOD小鼠(见表1～2)。

表1 各组小鼠成模情况 Tab 1 Model establishment in each group

表2 各组小鼠病理学评分 Tab 2 Scoring of pathology in each group

2.2 免疫组化VEGF表达VEGF在PBS组肝脏组织细胞和血管周围基本不表达。土三七组肝小叶结构破坏，肝组织细胞胞浆VEGF表达增多，几乎整个肝小叶均有表达。肝窦周围细胞胞浆表达最明显，中央静脉区相对较少。100 mg/kg丹参干预组肝窦周围细胞胞浆中VEGF表达明显增加，与土三七组比较，VEGF表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。200 mg/kg丹参干预组见散在的细胞胞浆VEGF表达，主要分布在肝窦周围细胞，与土三七组和100 mg/kg丹参组比较明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)(见图1、表3)。

图1 免疫组化VEGF表达(100×) A：PBS组；B：土三七组；C：100 mg/kg丹参组；D：200 mg/kg丹参组Fig 1 Immunohistochemical of VEGF expression (100×) A: PBS group; B: gynura segetum group; C: 100 mg/kg Salvia miltiorrhiza group; D: 200 mg/kg Salvia miltiorrhiza group

表3 各组小鼠VEGF免疫组化染色结果 Tab 3 Immunohistochemical of VEGF expression in each group

注：与PBS组比较，★P<0.01；与土三七模型组比较，☆P<0.01；与100 mg/kg丹参组比较，▲P<0.01。

2.3 肝组织VEGF mRNA的表达PBS组小鼠VEGF mRNA处于较低水平表达，土三七组小鼠VEGF mRNA处于较高水平表达；100 mg/kg丹参组小鼠肝组织VEGF mRNA表达较土三七组下降明显，200 mg/kg丹参组VEGF mRNA表达与土三七模型组比较显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2、表4)。

注：M：mark；A：PBS组；B：土三七模型组；C：100 mg/kg丹参组；D： 200 mg/kg丹参组。

分组例数OD值PBS组40.738±0.015土三七模型组40.885±0.030★100 mg/kg丹参组40.823±0.025★☆200 mg/kg丹参组3 0.778±0.012★☆▲

注：与PBS组比较，★P<0.05；与土三七模型组比较，☆P<0.05；与100 mg/kg丹参组比较，▲P<0.05。

3 讨论

HVOD是指肝小叶中央静脉和小叶下静脉损伤导致非血栓性管腔狭窄或闭塞而产生的肝内窦后性门脉高压症。临床表现为肝大、右上腹痛、腹水、黄疸[1]。后来发现肝窦内皮细胞首先受到损伤又命名为HSOS[6]。HVOD近年来临床报道有增多趋势，在国内土三七致HVOD报道多见。

丹参中提取的化学成分有脂溶性的丹参酮和水溶性成分如原儿茶醛、丹参素等。丹参的作用研究主要集中在改善心、肝、肺的缺血再灌注损伤、调节免疫应答和抗感染方面。我们课题组前期实验用土三七成功诱导HVOD模型的建立[3]，并证实丹参通过减轻肝窦内皮细胞损伤及肝窦纤维化等可预防HVOD发生[7]，丹参对HVOD的具体作用机制尚不清楚。

VEGF也称血管通透因子，是一种能特异地作用于血管内皮细胞的生长因子。IGUCHI等[8]报道HVOD患者VEGF表达升高；VEGF诱导血管收缩、新生血管形成及凝血组织在单核细胞中表达可能是HVOD发生的机制[9]；NAKAMURA等[10]提出抑制血管新生可以预防HVOD。本研究免疫组织化学染色证实土三七组VEGF在内皮细胞广泛表达，土三七组VEGF mRNA表达较PBS组明显升高。

本实验发现重度HVOD小鼠临床表现为一般情况差，食量减少明显，毛发无光泽，大量腹水，病理组织学改变Deleve修改后评分高，VEGF在核酸水平及蛋白水平表达均增加，提示VEGF表达水平与HVOD病情严重程度相关，由此推测VEGF表达水平可作为HVOD病情程度的重要指标。100 mg/kg丹参组VEGF mRNA水平表达较土三七组低。200 mg/kg丹参组VEGF表达较少，mRNA水平较土三七模型组和100 mg/kg丹参组均明显降低，说明丹参可抑制VEGF表达，抑制VEGF表达可减少HVOD的发生。200 mg/kg丹参组较100 mg/kg丹参组对VEGF抑制作用更明显，由此推测丹参对VEGF的抑制作用可能存在剂量依赖性。

综上所述，VEGF在HVOD发生中起重要作用，丹参对预防HVOD的发生可能与抑制VEGF的表达有关。