人耳软骨细胞冻存复苏后的体外成软骨能力及体内转归的研究

于瑶 殷宗琦 李丹 周广东 曹谊林 刘豫

软骨缺损在临床上较为常见，因软骨自我修复与再生能力低，自体软骨供体有限，使软骨缺损修复极为困难[1]。组织工程技术为从根本上解决组织、器官缺损的治疗提供了新的希望[2]，但组织构建过程所采用的支架材料极易在皮下等免疫机能活跃的移植部位引发炎症反应，干扰软骨再生。

我们的前期研究已建立了基于自体软骨细胞的组织工程软骨膜片和可注射软骨再生技术。该技术不依赖任何支架材料，不存在支架材料引起的免疫排斥反应，仅需极少量种子细胞，即可在体外诱导培养成新生软骨膜片[3]，可用于修复气管损伤、耳再造或全鼻再造等[4]。此外，将新生的软骨膜片进行颗粒化加工后制成软骨匀浆，可用于微创注射隆鼻或改善面部凹陷畸形[5]。但该技术采用的自体细胞来源有限，获得方式有创，且软骨细胞反复传代易老化，其形态、活性、表型会发生变化，部分功能将丧失。因此，对剩余种子细胞的储存就显得极为重要。

目前，深低温冷冻保存是应用于各类细胞长期储存最普遍的方式。本研究利用深低温冷冻保存技术，将获得的人耳软骨细胞进行1个月的储存，并在复苏后对细胞进行扩增、传代及体内外软骨再生等一系列实验，研究冻存对人耳软骨细胞的细胞活力、增殖和体外/体内软骨再生能力的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

普通健康裸鼠 （上海甲干生物科技有限公司），4～6周龄，雌雄不限，用于可注射软骨体内植入评价。实验严格依照实验动物保护指南的要求进行。

1.2 实验器材与试剂

高糖DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素-两性霉素 B（Hyclone公司，美国），胶原酶（Sigma公司，美国）、0.25%胰蛋白酶（Gibco 公司，美国），bFGF（R&D 公司，美国），CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所），Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒（Sigma公司，美国），Ⅱ型胶原定量试剂盒（Sigma公司，美国），酶标仪 （Multiskan Ascent V1.22,354-00187T，Instrument Type 公司，美国），全波长酶标仪（Thermo Fisher公司，美国），程序降温仪（Thermo Fisher公司，美国）。

1.3 实验分组及设计

软骨种子细胞的获取过程都存在一定的创伤性，为避免再次获取种子细胞造成的创伤、反复传代对细胞的影响以及种子细胞的浪费，本研究将原代软骨细胞培养并扩增至第1代 （P1），然后分成2组：将收集的P1代软骨细胞用FBS重悬后加入含10%DMSO的FBS混合液，经程序降温后储存至液氮中，1个月后复苏，随后进行扩增、传代与种膜，设为实验组（Exp组）；细胞不经冻存并继续扩增和传代至第3代（P3），按相同密度接种生成软骨膜片，设为对照组（Ctrl组）。评估两组体外软骨膜片的湿重、体积及形成质量。将两组软骨膜片分别颗粒化后注射至裸鼠皮下，体内培养8周后评估体内再生软骨的湿重、体积、软骨得率及形成质量等。

1.4 人耳软骨细胞的获取和培养

实验中应用的临床样本均来源于小耳畸形患者术中废弃的残耳软骨，均获患者知情同意。

将残耳软骨块剪成1 mm3碎块，加入0.15%胶原酶，震荡消化8～12 h，过滤，收集，去上清液，高糖DMEM重悬，按照0.5×106个/皿的密度接种于培养皿中，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养。每3天换液一次，待软骨细胞生长至75%～80%融合时传代[6-7]。

1.5 细胞冻存与复苏

收集细胞，FBS制备细胞悬液。配制冷冻保存溶液（使用前配制）：在离心管中加入含10%DMSO的FBS混合液，制成冻存液。取与细胞悬液等量的冻存液，加入细胞悬液中，制成细胞冻存悬液，最后DMSO的浓度为 5%～10%，细胞浓度为（1～5）×106cells/mL，分装于冷冻保存管中，1～2 mL/vial。放入程序降温仪中，按预先设定的程序执行，温度达到-80℃以下时，转入液氮中保存。复苏时用37℃温水快速晃动解冻，加入培养液后按0.5×106个/皿的密度接种到新培养皿中，隔天换液。

1.6 绘制细胞生长曲线

用CCK-8试剂盒测P3及复苏后P3细胞的第1、3、5、7、9 天的 OD 值，绘制成细胞生长曲线。

1.7 构建体外软骨膜片

将人残耳软骨细胞收集后，用常规DMEM细胞培养液重悬，按2.0×106个/孔的浓度接种于6孔板中，常规培养液培养3 d后改用无血清软骨重分化培养液，每天换液，培养2周[8]。

1.8 软骨膜片体外观察、湿重体积测定及颗粒化

弃培养液，PBS清洗3遍，用镊子将膜片与6孔板分离，用纱布尽量粘掉膜片表面的液体，称量并记录单个膜片的湿重，用排水法测得单个膜片体积。将膜片剪至浆状后PBS清洗并离心3遍（1 800 r/mim，5 min），弃PBS，将浆状软骨膜片分装至1 mL螺旋口注射器内。全程均为无菌操作。

1.9 体内再生软骨大体观察、湿重体积及软骨得率测定

注射后 8周取材，剥离表面的包膜，进行大体观察及湿重、体积及软骨得率的测量。

1.10 组织学染色

将标本固定于4%多聚甲醛 24 h，脱水、石蜡包埋，切片（厚度为 5 μm），进行苏木素-伊红染色，观察组织结构及细胞外基质分泌情况。

1.11 生化成分定量检测

采用Alcian Blue法检测再生软骨组织中的GAG含量，首先根据标准品浓度梯度绘制标准曲线，按照酶标仪比色结果（波长520 nm）与标准曲线计算样本GAG含量。以样本碱水解法检测再生软骨的总胶原含量，根据酶标仪比色结果（波长550 nm）与计算公式得到样本中总胶原的含量。采用hoechst 33258染色法进行DNA定量检测，根据DNA标准品浓度梯度绘制标准曲线后，按照酶标仪检测结果（激发光为480 nm，发射光为520 nm）与标准曲线，计算样本中DNA含量。

1.12 统计学分析

分析体内外再生软骨的湿重、体积、生物化学定量检测结果及体内再生软骨的软骨得率等定量指标，以（x±s）表示，SPSS 17.0 软件进行单样本 t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组软骨细胞形态、活性、功能

光镜下两组软骨细胞的大小、形态均无明显变化，未出现增大、铺展、老化、去分化等，传代扩增到第3代时，细胞大小及形态均无明显变化，2～3 d达80%～90%融合。复苏后扩增至第3代时依然呈现良好的形态特征。活/死染色、HE及阿利新蓝染色可观察到两组软骨细胞完全伸展后呈三角形或多角形，且细胞可正常分泌ECM（图1）。

2.2 细胞增殖曲线

通过生长曲线可观察到第3天时两组软骨细胞增殖能力均明显增强，第7天开始细胞增殖变慢。增殖曲线符合细胞生长规律，并显示Ctrl组与Exp组细胞增殖情况无明显差异（图2）。

2.3 细胞经程控降温仪程序降温

本实验中降温速度为-0.01～-60℃/min，温控精确度达到了0.01℃/min，温度达到-80℃以下时，转入液氮中长期保存。有效控制了DMSO在4℃以上与细胞接触的时间。

2.4 体外软骨膜片及颗粒化软骨

两组软骨细胞均按照相同密度接种，经体外培养2周后，均形成了瓷白色、表面光滑且具有一定厚度及力学强度的软骨膜片（膜片有一定的韧性、镊子正常操作过程中无断裂、破碎等现象）；用无菌剪刀将体外软骨膜片剪碎成浆状，分装至1 mL螺口注射器中（图 3）。

2.5 体内再生软骨组织大体及组织学观察

两组可注射软骨注射至裸鼠皮下即刻，均有一定程度的水肿样表现，8周时均有一定程度的吸收；8周后取材，两组颗粒化软骨均可在体内形成软骨样组织块，Ctrl组形成的软骨样组织颜色为白色，表面较光滑，具有一定的力学强度；Exp组表面光滑，颜色、质地与Ctrl组相比较无明显差异，但体积略小；两组软骨样组织均有一定的硬度和弹性。HE染色可见体内再生软骨样组织中软骨块并不是连续的，而是呈岛状分布，两组软骨样组织均形成软骨陷窝，陷窝间有蓝染的胞外基质成分，形态成熟，Ctrl组软骨块分布较稀疏，Exp组较为紧密（图4）。

2.6 体外再生软骨湿重及体积

体外培养2周时，Ctrl组及Exp组的体外膜片的湿重分别为（0.42±0.04） g和（0.38±0.45） g；体积为（0.33±0.03） mL 和（0.34±0.04） mL。 统计结果表明，Ctrl组膜片湿重与Exp组之间具有统计学差异（P＜0.05）；Ctrl组膜片体积与 Exp 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.7 体内再生软骨湿重、体积及软骨得率

体内培养8周，Ctrl组及Exp组体内再生软骨的湿重分别为（0.17±0.005） g 和（0.18±0.005） g；体积为（0.21±0.02） mL 和（0.11±0.013） mL；软骨得率为（42±4.00）%和（41.2±2.68）%。 Ctrl组体内再生软骨的湿重与Exp组比较，差异明显（P＜0.05）；两组体内再生软骨的体积和再生软骨的得率均无明显差异（P＞0.05）。由此可知，冻存对体内软骨的再生无明显影响。

2.8 体内外再生软骨的DNA、总胶原及GAG定量检测

体外培养2周后，Ctrl组与Exp组的DNA含量分别为（4.41±0.17）ng/mg 和（4.20±0.07） ng/mg；总胶原含量为（0.39±0.004） μg/mg和（0.35±0.01） μg/mg；GAG 含量为（10.75±0.69） μg/mg和（10.19±0.46） μg/mg。两组的DNA及GAG定量无显著性差异 （P＞0.05）；Ctrl组总胶原定量与Exp组相比差异明显（P＜0.05）。

体内8周后，Ctrl组与Exp组的DNA含量分别为（16.17±0.34） ng/mg 和（15.86±0.07）ng/mg；总胶原含量为（0.34±0.08） μg/mg 和（0.492±0.08） μg/mg；GAG含量为（17.05±0.83） μg/mg和（16.22±1.09）μg/mg。两组的DNA及GAG定量无显著性差异 （P＞0.05）；Ctrl组总胶原定量与Exp组相比差异明显 （P＜0.05）。总体观察，体内再生软骨的DNA、总胶原、GAG含量整体高于体外再生软骨。

图1 两组软骨细胞的形态、活/死及组织学染色Fig.1 Morphological observation,live/dead and histological staining of chondrocytes in the 2 groups

图2 两组软骨细胞的增殖曲线Fig.2 Growth curve of chondrocytes in the 2 groups

图3 体外2周软骨膜片Fig.3 Chondrocyte sheet after 2 weeks'culture in vitro

图4 体内培养8周再生软骨的大体及组织学观察Fig.4 Gross view and histological observation of regenerated cartilage after 8 weeks'culture in vitro

3 讨论

组织工程技术为从根本上解决组织、器官缺损的治疗提供了新的希望[9]。软骨膜片由自体软骨细胞及其分泌的细胞外基质构成，不依赖任何支架材料，不存在支架材料引起的免疫排斥反应，已在软骨再生领域得到广泛应用[10-11]。软骨膜片进行颗粒化加工后制成软骨匀浆，可用于微创注射隆鼻或改善面部凹陷畸形[9]。但种子细胞的获取依然是限制其发展的一个重要因素。

目前，低温冷冻保存是应用于各类细胞长期储存的最普遍方式。冻存和复苏的过程包括：程序降温-低温储存-融冻-培养-传代-接种，其中任一步骤的失败都会影响细胞的活性，并导致细胞不可逆的损伤[12]。在方法得当、操作正规的基础上，DMSO低温冻存的人软骨细胞复苏后，其细胞形态与冻存前无明显差异，增殖与分化能力可保持3～4代[13]。本实验中，从光镜、细胞爬片染色、增殖曲线来看，Ctrl组与Exp组细胞均可正常增殖，且具备良好的活力和基质分泌功能。体外再生软骨样组织的大体及组织学染色观察可见Ctrl组与Exp组细胞均形成大量软骨陷窝，且有蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达，两组DNA及总GAG定量均未表现出明显差异。实验组体外膜片湿重及总胶原定量略高于对照组，提示Exp组膜片含水量较高及所分泌的总胶原较高，总胶原的组成成分及两组间的差异尚需更为深入的研究。

体内培养8周后，两组再生软骨样组织表面较光滑，颜色为白色；组织学染色可见两组软骨细胞均形成大量软骨陷窝；软骨得率都在40%左右；两组DNA及总GAG定量均未表现出明显差异；体内再生软骨的总胶原定量两组有统计学差异，这可能是由于体内再生软骨样组织中软骨块并非连续存在而是成岛状分布导致的。

通过湿重、体积、软骨得率、组织学及生化成分定量检测可观察到，Ctrl组体内外再生软骨与Exp组相比，差异没有统计学意义（P＞0.05），说明冻存对软骨细胞没有明显影响。

本实验中，两组软骨细胞在体内外均形成了正常的软骨样组织，说明冻存对体内外软骨再生能力无明显影响。但本实验冻存的时间仅1个月，更长期的冻存是否会对再生软骨造成影响尚需进一步研究证实。

4 结论

经冻存的软骨细胞在形态、活力、增殖能力、软骨特异的GAG分泌能力、体内外软骨形成能力等方面与未经冻存的软骨细胞相比没有明显差异。