高压静电场技术制作藻酸钙载药微球及其性能研究

王宗鑫 张永军 陈维明 徐勇 周广东

药物缓释系统能更好地保持药物活性，延长药物有效作用时间，使药物缓慢、规律地释放，减少了大剂量多频次用药造成的副作用，用药更加便捷安全[1]。藻酸钙凝胶是目前药物缓释研究的热点之一，是由藻酸钠溶液与Ca2+反应形成的单网络水凝胶，有较好的生物相容性，可负载细胞或药物[2]。因具有较好的可塑性，藻酸钙凝胶被用作药物缓释系统时，多被制作成微球。然而，目前制作藻酸钙微球采用乳化方法，有机溶剂易破坏药物的活性并存在溶剂残留风险[3-4]。另外，藻酸钙微球直径较大，且大小不均匀，严重阻碍了这种药物缓释系统的临床应用。高压静电场技术通过高压静电使针头内的液体带电，由于静电斥力使液滴分裂成细小的微滴，接触Ca2+后被交联成微球，高效、可控、简便[5]。本研究尝试采用高压静电场技术，从电压、藻酸钠浓度、CaCl2浓度、离心转速和针头直径等5个方面，探索最佳参数组合，并采用牛血清白蛋白（BSA）为模型药物，探索这类微球的体外缓释行为。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

无水CaCl2（美国Sigma），藻酸钠 （分子量67 KD，美国 Sigma），磷酸盐缓冲溶液（PBS，美国 Sigma）,牛血清白蛋白（BSA，纯度＞98%，上海阿拉丁），BCA微量蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天），直流高压发生器（美国Spellman），10 ml注射器（上海康德莱），磁力搅拌器（德国IKA），场发射扫描电子显微镜JEOL-6380LV（日本电子株式会社），光学显微镜（日本 Nikon），恒温摇床（德国 IKA），酶标仪（美国 Thermo）。

1.2 藻酸钙载药微球的制备

取一定质量的藻酸钠粉末加入去离子水中，置于50℃水浴中搅拌，彻底溶解，静置过夜去除气泡后用注射器抽取，将针头与高压直流电源连接；另将CaCl2溶液放置于磁力搅拌器上，接收距离10 cm，打开电源，液滴受到重力和电势差驱动力形成射流，进入CaCl2溶液，形成载药微球。继续交联30 min后，去离子水洗去表面的CaCl2溶液（图1）。

图1 藻酸钙微球制作模式图Fig.1 Pattern diagram of calcium alginate microspheres

1.3 微球直径和表面形态观察

随机选取约100粒微球，40倍视野下用光学显微镜拍照，使用Image J软件进行微球直径测量。微球冻干后，随机取约100粒微球黏附于电镜载物台上，抽取真空，喷金后观察微球表面形态。

1.4 最佳电压

我们综合大量已有的制作参数，采用1 M CaCl2、1%藻酸钠、200 r/min和30 G针头。电压分别采用2 KV、10 KV和16 KV。筛选最佳电压方法：使用光学显微镜和电镜对微球直径和表面形态进行观察。筛选标准：直径最小，标准差最小，形态规整。

1.5 最佳藻酸钠浓度

在 16 KV、1 M CaCl2、200 r/min、30 G 针头基础上，分别测试0.5%、1%、1.5%藻酸钠，筛选方法和标准同1.3。

1.6 最佳CaCl2浓度

在 16 KV、0.5%藻酸钠、200 r/min、30 G 针头基础上，分别测试 0.5 M、1 M、1.5 M CaCl2，筛选方法和标准同1.3。

1.7 离心机最佳转速

在 16 KV、1 M CaCl2、0.5%藻酸钠、30 G 针头基础上，分别测试 200 r/min、600 r/min、1 000 r/min，筛选方法和标准同1.3。

1.8 最佳针头大小

在 16 KV、1 M CaCl2、0.5%藻酸钠、200 r/min 基础上，分别测试27 G、30 G、32 G针头，筛选方法和标准同1.3。

1.9 3种载药微球的药物包封率和载药率

采用最佳参数组合，制作1%、3%、5%BSA浓度的藻酸钠BSA混合液，分别设为L组、M组和H组。微球制作完毕后，收集烧杯内剩余液体和微球洗涤液，使用BCA微量蛋白浓度测定试剂盒测定其未包封的BSA含量（最大吸收峰在280 nm），同时用微量天平秤量微球总重量。包封率=（BSA总量-未包封BSA含量）/BSA总量×100%，载药率=（BSA总量-未包封BSA 含量）/微球总重量×100%[6]。

1.10 3种载药微球的体外释放实验

各组分别秤取100 mg的载药微球，放入15 mL离心管中，加入10 mL PBS液（pH 7.4），拧紧盖子，将其置于37℃恒温摇床上，转速100 r/min，分别在第 2、4、8、24小时和第 3、7、14、28 天离心后，吸走全部缓释液，添加10 mL新鲜PBS液。以BCA微量蛋白浓度测定试剂盒测定缓释液中BSA含量，即此时间段微球药物释放量。累积释放量=BSA释放量/微球中BSA总量×100%。

1.11 统计学分析

使用 SAS 9.4（SAS Institute Inc.，美国）统计学软件，所有计量数据以（±s）表示，对各组间的数据比较使用Student-Newman-Keuls法或Dunnett法行方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微球形态学观察

当电压为16 KV，藻酸钠浓度为0.5%，氯化钙浓度为1 M，转速为200 r/min，针头为30 G时，成球效果较好，具有较小的平均直径且大小均一。使用其他参数时，有时虽能成球形，但平均直径大，或大小不均一，或形状不规则（甚至不能成球形）。根据制作载药微球的原则，考虑选取电压16 KV、藻酸钠浓度0.5%、氯化钙浓度 1 M、转速 200 r/min、针头 30 G，作为最佳参数组合来制备微球。扫描电镜结果与光镜结果一致，微球冻干后形态虽有变化，但大小较均匀，适合下一步制作载药微球（图2～6）。

图2 不同电压组的微球形态Fig.2 Morphology of microspheres in different voltage groups

图3 不同藻酸钠浓度组的微球形态Fig.3 Morphology of microspheres in different alginate concentration groups

图4 不同CaCl2浓度组的微球形态Fig.4 Morphology of microspheres in different CaCl2 concentration groups

图5 不同转速下的微球形态Fig.5 Morphology of microspheres at different rotational speeds

图6 不同型号针头下的微球形态Fig.6 Microsphere morphology under different types of needles

2.2 载药微球包封率及载药率

BSA标准曲线的线性回归方程为：Y=1.5038X+0.1095，R2=0.9981（图 7）。 以此线性方程为基础，计算得到L、M、H组微球的包封率分别为 （91±1.46）%、（85±1.63）%、（79±3.29）%，载药率分别为（0.89±0.04）%、（2.56±0.57）%、（4.10±1.21）%。可见随着初始给药量的增加，包封率逐渐减小，载药率逐渐增加。

图7 BSA溶液的标准曲线Fig.7 Standard curve of BSA solution

2.3 载药微球体外释药

不同载药浓度微球的粒径分析，加药后3组微球的直径没有明显变化，在一定载药浓度范围下，药物不会影响微球的直径。药物累计释放率检测显示，使用最佳参数组合制备出的3组微球缓释持续时间较长（＞28 d），并都具有典型的三相释放规律。载药微球放入PBS释放介质后的24 h内，药物释放速度较快，3组累积释放率在25%～40%之间，24 h后释药曲线逐渐变缓，后期释放逐渐加速。另外，随着载药量的增加，各时间点的释放速率也在增加，因此可以根据载药量调节释放速率（图8）。

图8 各组BSA-藻酸钙微球粒径分析及体外缓释曲线Fig.8 Particle diameter analysis and sustained release curve of BSA-calcium alginate in each group

3 讨论

藻酸钠是从藻类植物中提取的一种天然生物活性大分子，来源广泛，降解产物为CO2、H2O和Na+，生物安全性高，被广泛应用于食品和药品行业[7]。藻酸盐敷料被美国FDA批准应用于皮肤创面的修复[8]。藻酸钠分子由G单元和M单元组成，其中的Na+可以与某些金属离子进行交换，后者可与G单元交联形成“蛋盒结构”，由溶液向凝胶转变[4]。金属离子（如 Cu2+、Pb2+、Co2+和 Mn2+）可作为交联剂，但具有一定的毒性，Ca2+的生物相容性更高，一般使用CaCl2作为交联溶液[2，8]。藻酸钙凝胶也具有很高的生物相容性，在组织工程领域被用于干细胞或终末细胞的3D培养，可以较好地促进干细胞分化，保持终末细胞的表型[2]。藻酸钙微球缓释体系制作方便，药物包封率高，与用人工合成化合物制作的微球（如PLGA微球）相比，生物相容性更佳，具有很好的应用前景。制作藻酸钙微球一般采用乳化方法，多采用二氯甲烷等有机溶剂作为油相，可能破坏药物的活性，且存在溶剂残留的风险。我们采用高压静电场技术制作微球，制作过程不使用有机溶剂，更加安全。

目前该技术制备的载药微球直径较大且形状不均匀，还未探索出最佳参数组合，微球缓释行为也未深入研究，故本研究拟探索制备的最佳参数组合，以制备出直径更小更均匀的微球，并在此基础上研究载药后的缓释行为。

高压静电场技术需使用4个装置，即高压电源、注射器、微球接收容器和磁力搅拌器[5]。高压电源与注射器针头连接使针头内的藻酸钠液体带电，接收容器内液体与针头之间的电势差是驱动射流的动力。藻酸钠液体带电后由于静电斥力液滴分裂成微小液滴，集聚成高速射流进入Ca2+溶液被交联固化[9]。磁力搅拌器的适当搅拌可使藻酸钙液滴被快速、充分地交联，并避免局部凝胶微球的聚集。

藻酸钙微球的直径大小与电压、CaCl2浓度、藻酸钠浓度，以及磁力搅拌器的转速和针头直径等因素有关。以往的研究未综合考虑这5个参数的有机整合。我们首先综合了其他既有研究的参数，设置合理的藻酸钠浓度、CaCl2浓度，以及转速和针头规格，探索电压对直径大小的影响。随着电压的增加（达到16 KV），微球直径降低，这可能是由于电压的增加使得液滴的分裂更加充分，液滴更小造成的[5]。藻酸钠溶液浓度越小（0.5%），黏性越小，在施加电压后液滴更容易分裂，液滴越小[5，10-11]。CaCl2的浓度越大（1.5 M），虽然制作出的微球平均直径变小，但是大小不一，标准差变大，不宜采用。平均直径变小是因为CaCl2的浓度越大，导电性越高，针头与CaCl2液体之间的电势差就越大，加载到针头上的电压相对变大[10]。标准差变大的原因可能是CaCl2的浓度越大，液滴更快地被交联固化，液体剪切力打散部分微滴，一部分未打散。1 M CaCl2浓度制作出的微球大小适中，形态规整，可采用。转速越大（1 000 r/min），液体剪切力越大，会使形成的微球撕裂变形，因此转速不宜过大，200 r/min较为合适。由于藻酸盐黏度较大，针头直径过小（27 G），液体不易流出，影响了液滴的分裂，针头直径过大（32 G），液体流出过快，不能充分分裂，所以30 G的针头比较适合。以上参数组合，制作成的微球比其他文献报道的直径更小[5]，释药的比表面积更大，药物释放更加高效[12]。同时，更容易注射[6]，或与其他凝胶介质混合[7]。微球大小均匀，标准差更小，生产过程中易于质控，实际使用时，剂量更精准。因此，16 KV电压、1 M CaCl2浓度、0.5%藻酸钠浓度、200 r/min和30 G的针头是最佳参数组合。

我们对藻酸钙微球的缓释行为的研究采用了BSA作为模型药物，设置了低、中、高3个药物浓度，研究了药物包封率、载药率和体外缓释规律。3组的药物包封率都很高，说明该方法制作的藻酸钙微球有很好的药物包封能力，可有效阻止微球制备过程中药物向外部的渗漏，减少药物浪费。结果表明，初始给药量越少，缓释载体（藻酸钙凝胶）和药物的比例就越高，缓释载体就把药物包封得更加充分，从而获得更高的包封率，但载药率相应减少[11]。3组药物浓度的缓释微球都能够保持较长的药物释放时间（至少28 d），缓释效果明显。原因可能是：藻酸盐分子中只有G单元被Ca2+交联，所以本研究采用G/M比值高的藻酸钠作为原料，交联程度更高，降解更慢，药物包封更加充分，所以缓释时间更长[4，8]。

通过分析3组的体外累计缓释曲线（pH 7.4）可见：3组曲线都分为3个阶段，即突释期、缓慢释放区和加速释放区[6]；另外，载药浓度越高，各阶段的累计释放比例越高。微球缓释系统中药物释放的主要机制为：突释、扩散和降解[1]。突释现象的产生是因为黏附在微球表面及临近表面的药物，在短期内快速溶解造成的[13]。然而，藻酸钙微球突释现象的产生又有着特殊之处，是由于藻酸盐在CaCl2溶液中被交联，交联后为了进一步增加机械性能，浸泡了一段时间，而后用水洗去了微球表面的CaCl2溶液，这一系列操作会造成微球表面黏附的药物大部分损失，因此在研究缓释行为时，突释的产生主要是临近微球表面的药物起主导作用，最外面的药物很少，起次要作用。载药量大，表面的药物颗粒就越多，溶解后留下的通道就越多，溶液更容易进入微球内部，临近表面的药物溶解越快，所以载药量多的分组突释现象更加明显[13]。虽然3组都可观察到突释现象，但是突释并不剧烈，即使高载药组也未超过40%。起始阶段释放一定的药量可作为基础药量，随着药物的代谢，后面阶段药物的释放可以补充药物的损失，以维持局部有效药物浓度。

突释现象后，扩散行为起主要作用，进入慢速缓释阶段。扩散与微粒直径、溶液进入微球的通道数量、浓度梯度有关。因为3组直径差别不大，扩散距离基本一致，所以通道数量、浓度梯度起主要作用[13]。如前述，高载药组的通道数量更多，溶液进入微球内部更多，药物的溶解扩散更多。另外，高载药组微球内外的药物浓度梯度差更大，化学驱动力更高，更容易扩散出来。所以，此阶段高载药组的释放比例更高。随着时间的延长，藻酸钙缓释支架逐渐降解，内部凝胶网络崩塌，药物快速释出，因此进入快速释药阶段。本研究所采用的缓释溶液是在pH 7.4的PBS液中进行的，PBS液中存在着大量金属离子，会和凝胶中的交联剂Ca2+进行缓慢的离子交换，藻酸钙微球支架发生解聚降解。如前所述，高载药组由于药物/支架比增加，藻酸盐比例较少，分解更快，加之溶液进入微球内部的通道更多，水分子和其他金属离子大量进入加剧了凝胶分子链的解聚，包封的药物大量溶解释出。可见，藻酸钙微球的直径、载药量都可以影响其药物缓释行为。我们经过最佳参数组合的摸索，制备出的微球具有较高的包封率，缓释持续时间较长，并且具有典型的三相释放规律，是一种良好的药物缓释系统。

4 结论

本研究采用高压静电场流技术成功制备出藻酸钙微球，该方法简便，易于调控参数，无有机溶剂，生物相容性更高。通过光镜和电镜观察微球的形态和直径，确定了最佳参数组合。本方法制备的微球具有更小的直径，且更为均匀，形状规则，性状稳定。这种微球负载模型药物BSA时，具有很好的药物包封率，体外缓释时间较长，释放行为稳定、规律。在将来的研究中可以此注射或复合其他生物材料进行药物缓释，临床应用前景广泛，潜力巨大。