太行山区酸枣叶化学成分的UPLC-QTOF-MS分析

叶 嘉，杨明建，杨香瑜，张 浩，昝立峰*

1邯郸学院生命科学与工程学院；2河北省高校冀南太行山区野生资源植物应用研发中心，邯郸 056005

酸枣(Ziziphusjujubavar.spinosa)隶属于鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus)木本植物，一种灌木或小乔木，广泛分布于我国华北、西北等地，尤其在太行山地区野生资源十分丰富[1]。酸枣干燥成熟种子酸枣仁是中医常用的宁心安神药，具补肝、宁心、敛汗、生津等功效[2]。而酸枣叶在我国民间广泛将其加工成茶，以养心安眠为其主要保健功效，具有利尿、促进胆酸合成、消炎等多种活性，常称作“东方睡叶”[3]。《本草纲目》中记载酸枣叶可“敛疮解毒，治胫臁疮”功能[4]，现代研究发现酸枣叶中主要含有生物碱、黄酮、三萜皂苷、有机酸等多种类型的化学成分，具有镇静抗惊厥、保温作用，并且可使心脑血管收缩性增强，致使血压持续下降[5]。

国内对酸枣叶的研究多集中在酸枣叶茶的加工技术研究方面，而对酸枣叶的化学成分及药理研究的文献报道较少。超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术兼具液相色谱的高效分离能力与质谱的高灵敏度、高检测能力，在天然产物的分析研究、药效物质基础研究等方面具有独特的优势。为了进一步明确产自河北省太行山区酸枣叶的活性成分，本研究利用UPLC-Q-TOF-MS技术对其乙醇提取物的化学成分进行了系统分析，建立酸枣叶化学成分的快速分析方法，为阐明其药效作用的物质基础提供实验方法和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸枣叶于2017年8月采集于河北省冀南太行山区五指山，采集后经摊晾、45 ℃烘干，5～8 ℃放置备用。

乙腈和甲酸为色谱级，其余试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q超纯水。LX-17型大孔吸附树脂由西安蓝晓科技新材料股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

Acquity UPLC-G2 QTOF 联用系统(美国Waters 公司)；Waters BEH Amide 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；N-1200B 旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；Mill-Q Advantage A10 超纯水仪(美国Millipore)；高速万能粉碎机(常州市国旺仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

采用多功能高速粉碎机对酸枣叶样进行粉碎(20～40目)，准确称取粉碎后的酸枣叶200 g，用60%的乙醇在超声波45 ℃辅助浸提2次，每次2 h，合并提取液并离心过滤，离心液在温度为40 ℃减压浓缩至无醇状态的水溶液，水溶液采用大孔吸附树脂吸附分离纯化，75%乙醇解吸得到解吸液，解吸液减压蒸发浓缩后冷冻干燥得到3.6 g物质，分析前用甲醇溶解并过0.22 μm滤膜，即得样品溶液。

1.3.2 色谱条件

色谱柱为Waters BEH Amide(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流动相A为水溶液(含0.5%甲酸)，B相为乙腈，流动相梯度洗脱过程如下：10%A(0～1 min)，10%～100%A(1～45 min)，100%A(45～47 min)，100%～10%A(47～47.1 min)，10%A(47.1～50 min)；流速为0.2 mL/min；进样量为10 μL；柱温40 ℃。

1.3.3 质谱条件

电喷雾电离(ESI)离子源，质量扫描范围质荷比 (m/z) 100～2 000，扫描方式为正负离子模式，毛细管电压为3 000 V，样品锥电压40 V，提取锥电压4 V，源温110 ℃，脱溶剂气温度300 ℃，脱溶剂气流速度700 L/h。

图1 酸枣叶提取物正(A)负(B)离子模式下的UPLC-Q-TOF-MS总离子流图Fig.1 The total ion chromatograms in positive (A) and negative ion mode (B) of extracts from Ziziphus jujuba var. spinosa folium using UPLC-Q-TOF-MS

2 结果与分析

图1为产自冀南太行山区酸枣叶乙醇提取物的UPLC-QTOF-MS总离子流色谱图，从图1中看出UPLC分离条件可以有效地将酸枣叶中的主要成分分开，在UPLC-QTOF-MS条件下得到质谱图，化学成分在ESI离子源正离子谱中主要出现 [M+H]+准分子离子峰；在负离子谱中黄酮、三萜酸、有机酸和脂肪酸主要出现 [M-H]-准分子离子峰，而三萜皂苷类物质则具有基本相同的一级质谱，基峰为 [M-H+HCOOH]-，二级质谱主要的碎片峰为[M-H]-，总离子峰面积为213 762 mV·min。

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2.1 黄酮类化合物

黄酮化合物的裂解规律已有较多的文献报道[6]，裂解规律相似，从酸枣叶乙醇提取物中共鉴定出10个黄酮成分，详细结果见表1所示。

化合物1和2在正负离子模式下均产生相同的分子离子峰，推测其可能为同分异构体，在负离子模式下准离子峰m/z595.166 4 [M-H]-，正离子模式下产生m/z597.183 3 [M+H]+的分子离子峰，确定化合物分子量为596，根据元素组成分析分子式为C27H32O15，二级、三级质谱碎片中有碳苷的常见碎片丢失，参照文献[7]并结合出峰时间推测化合物1和2分别为6,8-di-C-glucosyl-2(S)-naringenin或6,8-di-C-glucosyl-2(R)-naringenin。

化合物3和4在负离子模式下准分子离子峰m/z609.144 8 [M-H]-，碎片为463.087 6、301.032 9；正离子模式下化合物产生m/z611.160 9 [M+H]+的分子离子峰，二级质谱碎片离子m/z465.102 3由m/z611.160 9失去一分子鼠李糖(146)产生，进一步失去一分子葡萄糖(162)，产生碎片m/z303.050 3；确定化合物分子量为610，根据元素组成分析分子式为C27H30O16，且两个化合物产生相同的分子离子峰，结合出峰时间，参考文献[8]推测其分别为Quercetin-3-O-robinobioside和芦丁。

化合物5和7负离子模式下产生m/z593.148 8 [M-H]-分子离子峰，正离子基峰m/z595.168 0 [M+H]+，确定化合物分子量为594，产生碎片离子m/z449.108 6由m/z595.108 6失去一分子鼠李糖(146)产生，进一步失去一分子葡萄糖(162)，产生碎片m/z287.056 2；根据元素组成分析分子式为C27H30O15，且两个化合物产生相同的分子离子峰，推测为同分异构体，结合出峰时间并参考文献[9]推测其分别为Kaempferol 3-glucoside-7-rhamnoside和Kaempferol 3-rhamnoside-7-glucoside。

化合物6正离子模式下产生m/z581.149 7 [M+H]+的分子离子峰，碎片峰m/z303.051 9 由母离子脱掉1 分子阿拉伯糖(132)和1分子鼠李糖(146)产生，查阅数据库(Lipidomics Gateway)并参考文献[9]推断化合物为Kaempferol 3-rhamnoside-7-glucoside。

化合物8正离子分子离子峰为m/z447.092 3 [M+H]+，主要碎片为287.055 3和271.061 4，失去1分子葡萄糖苷(160)产生，并进一步脱氧(16)产生271.055 3碎片；负离子模式下产生m/z445.075 5 [M-H]-离子峰，确定分子量为446，根据元素组成分析分子式为C21H18O11，由数据库(Lipidomics Gateway)查阅推断化合物为黄芩苷(Baicalein 7-glucuronide)。

化合物9在负离子模式下产生m/z563.140 1 [M-H]-的分子离子峰，主要碎片为431.099 9和285.031 7；而正离子模式下，化合物产生m/z565.155 0 [M+H]+的分子离子峰，主要碎片为433.102 8和287.056 2，确定化合物分子量为564，根据元素组成分析分子式为C22H28O14，碎片433.102 8为母离子脱掉1分子木糖(132)，继续脱掉1分子鼠李糖(146)产生碎片287.056 2，参考文献[9]确定化合物为Kaempferol 3-rhamnoside-7-xyloside。

表1 UPLC-Q-TOF-MS鉴定酸枣叶提取物中的黄酮化合物Table 1 The flavonoids identified from Ziziphus jujuba var. spinosa folium by UPLC-Q-TOF-MS

图2 化合物山奈酚-3-葡萄糖-7-鼠李糖和槲皮素-3-木糖苷-7-鼠李糖的质谱图Fig.2 The mass spectra (positive mode) of compound kaempferol 3-glucoside-7-rhamnoside and quercetin 3-xyloside-7-rhamnoside

2.2 三萜皂苷

从酸枣叶中共鉴定出14个三萜皂苷成分，结构以达玛烷型三萜皂苷为主，糖多取代在C-3、C-20位，有L-鼠李糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、L-6-脱氧塔络糖和乙酰鼠李糖等，详细信息见表2所示。

化合物11在负离子模式下分子离子峰为m/z957.507 1 [M-H+HCOOH]-，而正离子模式下分子离子峰为m/z913.519 3 [M+H]+，确定分子量为912，分别失去1分子鼠李糖、1分子木糖、1分子葡萄糖产生碎片为767.454 0(146)、635.403 0(132)、473.340 4(162)，根据元素组成分析化合物分子式为C47H76O17，结合文献[10]推测化合物为Zizynummin。

化合物12在负离子模式下准分子离子峰为m/z1 103.563 8 [M-H+HCOOH]-，二级谱离子峰为m/z1 057.553 8 [M-H]-，而正离子模式下分子离子峰为m/z1 059.571 7 [M+H]+，确定分子量为1058，正离子模式产生碎片895.504 8、733.451 0、587.391 8、455.350 7，分别失去2分子葡萄糖、1分子鼠李糖和1分子阿拉伯糖。根据元素组成分析化合物分子式为C53H86O21，并查阅Chemical spider数据库，推测该化合物为Ilekudinoside A(Oleanolic acid 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranoside])。

化合物13和20负离子峰为m/z941.510 6 [M-H+HCOOH]-，二级谱离子峰为m/z895.507 4 [M-H]-，正离子峰为m/z897.524 1 [M+H]+，分子量为896，分子式为C47H76O16。正离子峰分别失去2分子鼠李糖和1分子阿拉伯糖产生碎片733.455 4、587.395 7、455.354 8，参考文献[11]，推测其为Jujubasaponin I(3-O-α-L-rhamnopyranosyl(l→2)-α-L-arabinopyranosyl-20-O-α-L-rhamnopyranosyl jujubogenin)及其异构体(Oleanolic acid 3-O-β-D-glucosyl-(1→3)-α-L-ramnosyl(1→2)-α-L-arabinoside)。

化合物14和21负离子基峰为m/z983.523 6 [M-H+HCOOH]-，二级谱离子峰为m/z937.519 3 [M-H]-，正离子峰为m/z939.528 9 [M+H]+，综合确定分子量为938，分子式为C49H78O17。正离子峰分别失去2分子鼠李糖和1分子阿拉伯糖产生碎片733.455 9、587.393 6、455.359 2，参考文献[11]，并结合出峰时间推测其为Jujubasaponin II和Jujubasaponin III。

化合物15负离子基峰为m/z1 005.527 7 [M-H+HCOOH]-，二级谱离子峰为m/z959.523 3 [M-H]-，正离子峰为m/z961.539 1 [M+H]+，综合确定分子量为942结合1分子水，分子式为C48H80O19(C48H78O18·H2O)。正离子峰产生碎片797.471 0 [961-hexosyl+H]+、651.402 7 [797-deoxyhexosyl+H]+，同时失去1分子半乳糖、1分子葡萄糖和1分子鼠李糖形成碎片587.395 8、489.359 9、455.357 9，结合文献[12]，推测化合物为Jujubasaponin Ⅳ或Ⅴ。

化合物16正离子基峰为m/z797.474 4 [M+H]+，确定分子量为796，分子式为C42H68O14，产生碎片651.4125 [M+H-deoxyhexosyl]+，参考文献[12]，推测化合物为Jujubasaponin Ⅵ[Trevoagenin D 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside]。

化合物17在正离子模式下基峰为m/z1 045.559 4 [M+H]+，分子量为1 044，分子式为C52H84O21，分别失去1分子L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、6-deoxy-L-talose和木糖产生碎片947.521 0、733.452 1、587.395 0、455.352 9，参照文献[13]推测化合物为Zizyphus saponin III。

化合物18和19在正离子模式下基峰为m/z931.528 4 [M+H]+，分子量为930，分子式为C47H78O18·H2O，分别失去1分子阿拉伯糖、葡萄糖和鼠李糖，产生碎片785.467 4、653.424 0、455.359 2。参照文献[13]并根据出峰时间推测化合物为Zizyphus saponin I和II。

化合物22正离子基峰为m/z1 075.570 8 [M+H]+，分子量为1 074，分子式为C53H86O22，结合碎片信息参照文献[14]鉴定为Jujuboside I。

化合物23和24在正离子模式下基峰为m/z981.541 2 [M+H]+，分子量为980，分子式为C51H80O18，失去系列糖产生碎片835.484 4、733.453 4、587.391 5、455.351 5，结合文献[15]推测化合物分别为Ziziphin和其异构体(3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-α-L-arabinopyranosyl-20-O-(2,3-di-O-acetyl)-α-L-rhamnopyranosyl jujubogenin)。

表2 UPLC-Q-TOF-MS鉴定酸枣叶生茶中的皂苷化合物Table 2 The saponins identified from Ziziphus jujuba var.spinosa folium by UPLC-Q-TOF-MS

图3 化合物大枣皂苷 I和Ziziphin的质谱图Fig.3 The mass spectra (positive mode) of compound zizyphus saponin I and ziziphin

2.3 三萜酸

酸枣叶中含有大量的三萜酸类次生代谢产物，主要结构为羽扇豆烷型、齐墩果烷型及美洲茶烷型等五环三萜类。裂解规律具有基本相同的一级质谱，如化合物25和34具有相同的基峰和碎片离子，在负离子模式下基峰为m/z485.326 7 [M-H]-，2倍分子量m/z971.661 4 [2M-H]-，失去1分子水产生碎片469.332 6，正离子模式下基峰为m/z487.342 4 [M+H]+，2倍分子量 [2M-H]-为m/z973.675 8，确定化合物分子量为486，正离子模式失去1分子羧基产生碎片441.336 8，进一步失去1分子水产生碎片为423.320 1。根据元素组成分析化合物分子式为C30H46O5，结合化合物出峰时间，推断化合物25和34分别为美洲茶酸(Ceanothic acid)和异美洲茶酸(Epiceanothic acid)。其他三萜化合物裂解规律与化合物25相似或相同，结合文献[16-19]共鉴定出13个三萜类化合物，结果如表3所示。

表3 UPLC-Q-TOF-MS鉴定酸枣叶中的三萜酸化合物Table 3 The triterpenic acids from Ziziphus jujuba var.spinosa folium by UPLC-Q-TOF-MS

图4 化合物美洲茶酸(正)和白桦脂酸(负)的质谱图Fig.4 The mass spectra of compound ceanothic acid (positive mode) and betulinic acid (negative mode)

2.4 生物碱化合物

酸枣叶中生物碱可以延长环己烯巴比妥干预小鼠睡眠时间起到镇静作用，具有一定的安神作用[21]。通过化合物的分子基峰、碎片信息以及查阅相关文献[20,21]，从酸枣叶中鉴定出3个生物碱化合物，见表4所示，其中化合物38在正离子模式下基峰为m/z286.144 8 [M+H]+，根据元素组成分析分子式为C17H19NO3，产生生物碱常见碎片107.049 6(C7H7O)，查阅Chemical spider数据库并参考文献，确定化合物为Coclaurine。同样化合物39和40产生碎片信息为269.088 3(C17H17O3)和107.049 6(C7H7O)，确定化合物39和40为Zizyphusine和Lotusine。

表4 UPLC-Q-TOF-MS鉴定酸枣叶生茶中的生物碱化合物Table 4 The alkaloids identified from Ziziphus jujuba var.spinosa folium by UPLC-Q-TOF-MS

图5 化合物乌药碱和酸李碱的质谱图Fig.5 The mass spectra (positive mode) of compound coclaurine and zizyphusine

2.5 有机酸及脂肪酸

参照文献报道有机酸和脂肪酸的裂解规律和质谱特征，并结合质谱数据库(lipidomics gateway)检索，共从酸枣叶醇提物种鉴定出13个有机酸和脂肪酸。如表5所示，裂解规律具有基本相同的一级质谱，如化合物44，在负离子模式下基峰为m/z315.254 0 [M-H]-，确定化合物分子量为316，失去1分子水产生碎片297.238 6，根据元素组成分析化合物分子式为C18H36O4，结合质谱数据库，推断化合物44为9,10-Dihydroxystearic acid。

表5 UPLC-Q-TOF-MS鉴定酸枣叶中的有机酸和脂肪酸Table 5 The fatty acids from Ziziphus jujuba var.spinosa folium by UPLC-Q-TOF-MS

图6 化合物十六烷酸和十八烷酸的质谱图Fig.6 The mass spectra (negative mode) of compound Hexadecanoic acid and Octadecanoic acid

3 结论

河北省冀南太行山区拥有丰富的酸枣资源，但综合开发利用深度不够，国内外学者对酸枣仁进行了大量的化学成分研究，但关于酸枣叶有效成分的系统认识仍然不足。本研究采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对酸枣叶乙醇提取物中的主要化学成分进行系统定性分析，采用正离子、负离子两种模式并结合相关文献资料对其成分进行推断，结果从酸枣叶乙醇提取物中鉴定出10个黄酮化合物、14个三萜皂苷、13个三萜酸、3个生物碱以及13脂肪酸物质。根据离子峰面积计算黄酮相对含量为51.54%、三萜皂苷相对含量为11.77%、三萜酸相对含量为17.00%、生物碱相对含量为11.68%、脂肪酸相对含量为6.95%，从相对含量分析发现酸枣叶中黄酮相对含量较高，占总含量的一半以上；脂肪酸种类较多，但相对含量较低。有研究表明黄酮化合物芦丁和6,8-di-C-glucosyl-2(S)-naringenin对血管有舒张作用，能拮抗血小板活化因子作用，可清除自由基，抑制生物膜上不饱合脂肪酸的过氧化而起到抗氧化作用，同时可延长戊巴比妥干预睡眠时间起到镇静作用，这与酸枣叶茶的养血安神作用相一致[8]。分析发现三萜皂苷类化合物为酸枣叶的主要成分，达玛烷型三萜皂苷化合物Ziziphin及其衍生物Jujubasaponins II-VI能够提高人体对蔗糖溶液味感的阈值起到甜味抑制作用，其中Ziziphin、Jujubasaponins II和III活性最强，可以作为甜味抑制剂产品的原料进行开发[15]。齐墩果烷型三萜类化合物Oleanonic acid通过抗补体作用，促进淋巴细胞增殖和巨噬细胞功能而具有免疫调节作用，化合物Betulinic acid通过抑制COX-1、COX-2 活性而具有抗肿瘤活性，故可以作为肿瘤细胞增殖抑制剂，或作为抗肿瘤药物先导化合物[19,20]。酸枣叶中丰富多样的物质具有良好的改善心肌功能及抗心肌缺血作用和安神镇静等多种药理活性和保健功能，这些化合物的发现可以为酸枣叶的功能深入研究奠定了理论基础。