天葵子化学成分及抑菌活性研究

刘学勇，姬志勤,2*

1西北农林科技大学植物保护学院；2陕西省植物源农药研究与开发重点实验室，杨凌 712100

天葵子为毛茛科植物天葵(Semiaquilegiaadoxoides)的干燥块根。作为一种传统中药，用于治疗肿瘤，乳痈，肾病等多种疾病[1]。其化学成分已经研究得较为透彻，主要有内酯及香豆素类、生物碱类、酚酸类、二萜类、硝基类及氰基类等[2]。目前在农用活性方面报道较少[3-5]，笔者对天葵子的化学成分进行分离鉴定，并测定其对几种常见农业致病菌的抑菌活性，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：岛津 SCL-10Avp高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Bruker RPX 500 MHz核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)；柱层析硅胶(200～300目，青岛海洋化工厂)；柱层析硅胶(300～400目，青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20(美国通用电气公司)；SENCO R210BL旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；SENCO W201/W501恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)；Thermo Fisher LCQ Advantage 质谱仪(美国热电公司)；WRR熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)；BWXG200半自动旋光仪(贝尔分析仪器有限公司)。

药品：硫酸链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)。

试剂：石油醚、乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、二氯甲烷、氯仿等均为国产分析纯；水为实验室自制超纯水。

1.2 植物材料

2016年5月购于安国市仁德兴药材有限公司，经南京农业大学园艺学院王康才教授鉴定为毛茛科天葵属植物天葵的干燥快根。药材标本存于西北农林科技大学农药研究所。

1.3 供试菌株

猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonassyringaepv.Actinidiae)；青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)；白菜软腐病菌(Erwiniacarotovorapv.Carotovora)；魔芋软腐病菌(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora(Jones) Bersey et al.)，菌种由西北农林科技大学植物保护学院农药研究所提供。

1.4 提取与分离

取天葵子样品20 kg，粉碎，甲醇超声提取3次，过滤，合并提取液，减压浓缩，得到浸膏。将浸膏加水稀释悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇1∶1萃取三次，浓缩得到石油醚相(141 g)、乙酸乙酯相(41 g)、正丁醇相(156 g)和水相(742 g)。取乙酸乙酯相用甲醇溶解，硅胶干法上样，以石油醚湿法装柱，硅胶柱依次用石油醚、V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) = 100∶1、20∶1、10∶1、7∶1、3∶1、1∶1、乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱，分别得到Y1(4.23 g)、Y2(2.45 g)、Y3(2.23 g)、Y4(1.03 g)、Y5(1.62 g)、Y6(1.43 g)、Y7(2.10 g)、Y8(1.78 g)、Y9(3.23 g)共9个组分。其中Y6经硅胶柱以石油醚/乙酸乙酯系统梯度洗脱(10∶1→ 8∶1→ 6∶1→ 4∶1→ 2∶1→ 1∶1→ 0∶1)，得到流份Y61-Y67，从Y64流份中进一步重结晶获得化合物3(25.2 mg)；Y65流份经硅胶柱层析，石油醚/乙酸乙酯系统等度洗脱(3∶1),获得化合物1(7.3 mg)、化合物5(6.1 mg)、化合物6(7.1 mg)；Y7流份经凝胶甲醇水纯化得到化合物10(4.5 mg)。

正丁醇相以二氯甲烷/甲醇系统硅胶柱层析，湿法装柱，干法上样,依次用体积比为20∶1、10∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1的洗脱剂洗脱，得到Z1(6.31 g)、Z2(10.13 g)、Z3(12.45 g)、Z4(15.26 g)、Z5(12.75 g)、Z6(8.23 g)、Z7(6.45 g)、Z8(26.42 g)共8个流份，Z2经二氯甲烷/甲醇(15∶1)等度洗脱，获得Z21-Z216共16个流份，Z25中析出大量白色粉末，甲醇反复淋洗，得到化合物4(17.2 mg),Z28经甲醇重结晶，获得化合物2(67.2 mg)；Z5用氯仿-甲醇-水(8∶2∶0.2)等度洗脱，共收集Z501-Z520共20个流份，每个流份200 mL，Z510经液相制备，获得化合物12(1.9 mg)；Z511和Z512合并经氯仿-醇-水(8∶2∶0.2)反复硅胶柱层析，得到化合物7(10.1 mg)、化合物9(40.6 mg)；Z6经氯仿-甲醇-水(4∶2∶1)反复硅胶柱层析，并结合薄层制备，获得化合物8(20.4 mg)；Z7经过丙酮洗涤，再经重结晶，获得化合物11(205.3 mg)，丙酮洗涤液浓缩后经液相制备，获得化合物13(12.4 mg)。

1.5 抑菌活性测定

采用滤纸片琼脂扩散法[6]分别测定了石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相及所分离化合物对4种供试病原菌的抑制活性。各相组份以10%的丙酮水配制成质量浓度为10 mg/mL的样品混悬液，各单体化合物用10%的丙酮水配制成1 mg/mL的样品溶液，取5 μL样品溶液转移至直径为6 mm的灭菌滤纸片，每片载药量为5 μg(各萃取相载药量为50 μg)，待溶剂挥发干后，均匀置于含菌平板上，每个平板放置6个滤纸片。溶剂对照为10%丙酮水溶液，阳性对照为硫酸链霉素(载药量0.5 μg/片)。28 ℃培养12 h后观察实验结果，直尺测量结果并记录。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

化合物1无色针状结晶(CH3OH)，易溶于甲醇、四氢呋喃，难溶于氯仿；1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:6.63 (1H,m,H-4),6.33 (1H,d,J= 9.2 Hz,H-5),5.84 (1H,br s,H-2),5.03 (1H,m,H-8),4.57 (1H,m,H-6),2.82 (1H,m,H-7a),1.54 (1H,m,H-7b);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:175.9 (C-1),166.3 (C-3),146.1 (C-5),120.4 (C-4),111.5 (C-2),80.1 (C-8),67.3 (C-6),41.1 (C-7)。以上数据与文献[7]报道一致，故鉴定为蝙蝠葛内酯。

化合物2无色针状结晶(CH3OH)，易溶于甲醇、四氢呋喃，难溶于氯仿；1H NMR (DMSO-d6,500 MHz)δ:6.56 (1H,dd,J= 2.7,9.8 Hz,H-4),6.33 (1H,dd，J= 9.8,92.1 Hz,H-5)，5.99 (1H，br s,OH-6)，5.94 (1H,s,H-2),5.62 (1H，s,OH-7),4.87 (1H,dd,J= 1.9,10.6 Hz,H-8),4.18 (1H,d,J= 7.9 Hz,H-6),3.36 (1H,t,J= 9.2 Hz,H-7);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz)δ:172.9 (C-2),163.0 (C-3),144.0 (C-5),118.7 (C-4),110.6 (C-3),82.9 (C-8),78.0 (C-7),71.4 (C-6)。以上数据与文献[8]报道基本一致，故鉴定为格列风内酯。

化合物3白色针状结晶(CH3Cl)，无紫外吸收，易溶于氯仿、甲醇。硫酸薄层显色为紫红色；1H NMR (CDCl3500 MHz)δ:5.34 (1H,dd,J= 5.0,2.0 Hz,H-6),3.51 (1H,tt,J= 11.06,4.63,4.63,H-3),1.00 (3H,s,H-18,19),0.92 (3H,d,J= 6.5 Hz,H-21),0.85 (3H,t,J= 7.1 Hz,H-27),0.82 (3H,d,J= 4.1 Hz,H-29),0.80 (3H,d,J= 4.1 Hz,H-26),0.67 (3H,s,H-18);13C NMR (CDCl3125 MHz)δ:140.9 (C-5),121.8 (C-6),71.9 (C-3),56.9 (C-14),56.3 (C-17),50.3 (C-9),46.0 (C-24),42.5 (C-4),42.5 (C-13),39.9 (C-12),37.4 (C-1),36.7 (C-10),36.3 (C-20),34.1 (C-22),32.1 (C-8),32,1 (C-7),31.8 (C-2),29.4 (C-25),28.4 (C-23),26.4 (C-16),24.4 (C-15),23.3 (C-28),21.3 (C-11),19.9 (C-26),19.5 (C-19),19.2 (C-27),18.9 (C-21),12.1 (C-29),12.0 (C-18)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故鉴定为β-谷甾醇。

化合物4白色块状物，无紫外吸收，微溶于氯仿、甲醇，溶于四氢呋喃。硫酸薄层显色为紫红色，三种溶剂系统TLC检测Rf值与胡萝卜苷对照品相同，故鉴定为胡萝卜苷。

化合物5白色针状结晶(CH3OH)，溶于甲醇，难溶于氯仿；1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.06 (2H,d,J= 8.5 Hz,H-2,6),6.73 (2H,d,J= 8.5 Hz,H-3,5),3.71 (2H,t,J= 7.2 Hz,H-8),2.7 (2H,t,J= 7.2 Hz,H-7);13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:156.8 (C-4),131.0 (C-1),130.9 (C-2,6),116.1 (C-3,5),64.6 (C-8),39.4 (C-7)。以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定为对羟基苯乙醇。

化合物6棕色油状物，易溶于乙酸乙酯；1H NMR (CDCl3,500 MHz)δ:7.70 (2H,t,J= 8.4 Hz,H-3,6),7.53 (2H,t,J= 8.4Hz,H-4,5),4.26 (2H,m,H-1′,1′′),1.71 (2H,dt,J= 12.0,6.1 Hz,H-2′,2′′) ″,1.43 (2H,m,H-7′,7′′),1.36 (4H,s,H-5′,5′′),1.31 (4H,m,H-3′,3′′),0.96 (4H,t,J= 7.3 Hz,H-6′,6′′),0.90 (6H,t,J= 7.3 Hz,H-8′,8′′);13C NMR (CDCl3,125 MHz)δ:168.0 (C-7,8),132.5 (C-1,2),131.2 (C-4,5),129.1 (C-3,6),68.4 (C-1′,1′′),39.0 (C-2′ 2′′),30.8 (C-3′,3′′),29.1 (C-4′,4′′),24.00 (C-7′,7′′),23.2 (C-5′,5′′),14.2 (C-6′,6′′),11.2 (C-8′,8′′)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定为邻苯二甲酸-二-2-乙基-己酯。

化合物7黄色针状结晶(CH3OH)，溶于甲醇、水；紫外灯下下显黄色荧光，改良碘化铋钾薄层显色阳性；1H NMR (DMSO-d6,500 MHz)δ:9.92 (1H,s,H-8),8.98 (1H,s,H-13),8.20 (1H,d,J= 9.1Hz,H-11),8.01 (1H,d,J= 9.1 Hz,H-12),7.79 (1H,s,H-1),7.09 (1H,s,H-4),6.17 (2H,OCH2O),4.96 (2H,t,J= 6.3 Hz,H-6),4.10 (3H,s,OCH3-10),4.07 (3H,s,OCH3-9),3.21 (2H,t,J= 6.4 Hz,H-5);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz)δ:150.4 (C-10),149.8 (C-3),147.6 (C-2),145.5 (C-8),143.6 (C-9),137.4 (C-13a),133.0 (C-12a),130.7 (C-4a),126.7 (C-11),123.6 (C-12),121.4 (C-8a),120.5 (C-13b),120.2 (C-13),108.4 (C-4) 105.5 (C-1),102.1 (OCH2O),62.0 (OCH3-9),57.1 (C-6),55.2 (OCH3-10),26.3 (C-5)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定为小檗碱。

化合物8黄色无定形粉末，易溶于水、甲醇；紫外灯下显亮蓝色荧光，改良碘化铋钾显色阳性；1H NMR (DMSO-d6,500 MHz)δ:6.71 (1H,d,J= 7.9 Hz,H-9),6.62 (1H,s,H-3),6.52 (1H,d,J= 7.9 Hz,H-8),4.36 (1H,d,J= 13.5 Hz,H-6a),3.72 (3H,s,OCH3-10),3.70 (3H,s,OCH3-2),3.58 (2H,m,H-5),3.32 (3H,s,N-CH3),3.17 (1H,m,H-4a),3.14 (1H,m,H-7a),2.89 (3H,s,N-CH3),2.84 (1H,dd,J= 18.0,4.8 Hz,H-4b),2.62 (1H,t,J= 13.1 Hz,H-7b);13CNMR (DMSO-d6,125 MHz)δ:150.5 (C-2),149.7 (C-10),149.3 (C-1),148.7 (C-11),125.1 (C-7a),121.9 (C-11a),121.6 (C-11b),120.0 (C-11c),114.3 (C-8),114.0 (C-3a),109.8 (C-9),108.8 (C-3),68.6 (C-6a),60.0 (C-5),55.5 (OCH3-10),55.1 (OCH3-2),52.5 (N-CH3),42.3 (N-CH3),30.0 (C-7),23.0 (C-4)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定为木兰碱。

化合物9黄色针状结晶(CH3OH)，ESI-MSm/z322 [M]+；易溶于水、甲醇；紫外灯下显黄色荧光，改良碘化铋钾显色阳性；1H NMR (DMSO-d6,500 MHz)δ:9.74 (1H,s,H-8),8.86 (1H,s,H-13),8.32 (1H,s,OH-10),7.86 (1H,d,J= 9.1Hz,H-11),7.86 (1H,d,J= 9.1 Hz,H-12),7.79 (1H,s,H-1),7.08 (1H,s,H-4),6.16 (2H,OCH2O),4.90 (2H,t,J= 6.3 Hz,H-6),4.06 (3H,s,OCH3-9),3.19 (2H,t,J= 6.4 Hz,H-5);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz)δ:151.1 (C-3),149.7 (C-10),147.7 (C-2),144.2 (C-8),141.3 (C-9),136.9 (C-14),132.6 (C-12a),131.2 (C-11),130.5 (C-4a),123.6 (C-12),122.2 (C-8a),120.6 (C-14a),120.3 (C-13),108.4 (C-4),105.5 (C-1),102.1 (OCH2O),63.1 (OCH3-9),55.1 (C-6),26.4 (C-5)。以上数据与文献[7,14]报道基本一致，故鉴定为唐松草酚定。

化合物10白色粉末，易溶于水、甲醇；无紫外吸收，硫酸薄层显色为黑色，与果糖共薄层，三种溶剂系统展开均有相同的Rf值，故鉴定为果糖。

化合物11白色针状结晶(H2O)， 易溶于水，微溶于甲醇；1H NMR (D2O,500 MHz)δ:6.39 (1H,dd,J= 10.2,2.0 Hz,H-4),6.18 (1H,dd,J= 9.9,3.1 Hz,H-5),5.69 (1H,s,H-2),4.91 (2H,d,J= 7.3 Hz,H-8,H-1′),4.87 (1H,m,H-8),4.33 (1H,dt,J= 5.4,2.5,2.5 Hz,H-6),3.96 (1H,m,H-7),3.76 (1H,dd,J= 12.3,5.7 Hz,H-6′),3.42-3.53 (4H,m,H-2′,3′,4′,5′ );13C NMR (DMSO-d6,125 MHz)δ:155.3 (C-3),138.1 (C-5),125.9 (C-4),117.1 (C-1),102.3 (C-1′),96.7 (C-2),76.9 (C-3′),76.5 (C-8),75.3 (C-5′),73.5 (C-7),73.0 (C-2′),70.2 (C-6),69.7 (C-4′),61.5 (C-6′)。以上数据与文献[7]报道基本一致，故鉴定为紫草氰苷。

化合物12红色针状结晶(CH3OH)，易溶于甲醇，微溶于水；1H NMR (CD3OD,500 MHz) δ:9.24 (1H,s,H-8),8.25 (1H,s,H-13),7.64 (1H,d,J= 8.1 Hz,H-11),7.56 (1H,s,H-12),7.48 (1H,H-1),6.90 (1H,s,H-4),6.03 (2H,s,OCH2O),4.81 (2H,t,J= 6.4 Hz,H-6),3.96 (3H,s,OCH3-10),3.11 (2H,t,J= 6.4Hz,H-5);13CNMR (CD3OD,125 MHz) δ:164.1 (C-9),151.2 (C-2),149.7 (C-3),145.1 (C-10),142.0 (C-8),140.8 (C-13a),134.4 (C-8a),129.5 (C-4a),129.2 (C-12a),126.0 (C-13),124.2 (C-12),121.8(C-1a),121.3 (C-11),109.1 (C-4) 106.3 (C-1),102.5 (OCH2O),61.1 (OCH3-10),57.1 (C-6),26.7 (C-5)。以上数据与文献[15]报道基本一致致，故鉴定为小檗红碱。

化合物13白色针状结晶(H2O)，易溶于水，微溶于甲醇，微溶于丙酮；mp.212～214 °C;ESI-MSm/z343 [M]+;[α]25 D-55 (c0.6,H2O);1H NMR (DMSO-d6,500 MHz) δ:6.28 (1H,dd,J= 10.2,1.8 Hz,H-2),6.07 (1H,dd,J= 10.0,3.2 Hz,H-3),5.74 (1H,s,H-7),5.02 (1H,s,OH-5),4.99 (1H,d,J= 5.5 Hz,H-1′),4.66 (1H,d,J= 6.8 Hz,H-6),4.61 (1H,dd,J= 7.8,1.6 Hz,OH-4′),4.14 (1H,q,J= 5.3 Hz,OH-3′),4.06-4.12 (2H,m,H-4,5),3.74 (2H,J= 12.2,6.3,2.9 Hz,H-6′),3.49 (1H,dt,J= 11.7,5.8,5.8 Hz,H-6′),3.40 (3H,s,OCH3-4),3.28-3.38 (4H,m,H-2′,3′,4′,5′),3.21 (1H,m,OH-6′);13C NMR (DMSO-d6,125 MHz) δ:155.7 (C-1),138.6 (C-3),126.9 (C-2),117.6 (C-8),102.8 (C-1′),97.2 (C-7),77.4 (C-3′),77.0 (C-6),75.8 (C-5′),74.5 (C-5),73.5 (C-2′),70.7 (C-4),70.2 (C-4′),62.0 (C-6′),53.0 (OCH3-4)。该化合物碳谱与化合物11类似，仅多了一个甲基信号，其氢谱、质谱等数据与文献[16,17]报道基本一致，故鉴定为bauhinin。

图1 化合物12和13的化学结构Fig.1 Chemical structures of compounds 12 and 13

2.2 活性数据

采用滤纸片琼脂扩散法测定天葵子石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相及单体化合物的抑菌活性，如表1所示。结果表明，乙酸乙酯相和正丁醇相在载药量为50 μg/片时对青枯病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、魔芋软腐病菌均有一定的抑菌效果，而石油醚相和水相抑菌效果较差。化合物7具有明显的抑菌活性，载药量为5 μg/片时对白菜软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径分别为19.4、13.3 mm；相同剂量下，化合物12对青枯病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径分别为13.2 、12.8 mm。

表1 各相萃取物及化合物对4种细菌的抑菌效果Table 1 The antibacterial activity of fractions and obtained compounds on 4 species of bacteria

注：RS：青枯病菌；PS：猕猴桃溃疡病菌；ECa：白菜软腐病菌；ECb：魔芋软腐病菌。

Note:RS:Ralstoniasolanacearum;PS:Pseudomonassyringaepv.Actinidiae;ECa:Erwiniacarotovorapv.Carotovora;ECb:Erwiniacarotovorasubsp.carotovora(Jones) Bersey et al.

3 结论与讨论

本研究对天葵子醇提物的化学成分进行了系统研究，从中分离得到13个化合物，并利用核磁共振波谱技术鉴定了其化学结构，主要为生物碱类、糖苷和小分子内酯化合物。天葵子主要抑菌活性部位为乙酸乙酯相和正丁醇相，从正丁醇相分离得到的抑菌化合物为小檗碱 (7)和小檗红碱 (12)，本研究对了解天葵子活性成分与农用价值有一定的指导意义。