基于1H-NMR的复合应激勃起功能障碍大鼠模型血清代谢组学及药物干预的研究*

艾孜孜·热合曼 刘凤霞 斯依提·阿木提 刘文娟 阿地力江·伊明**

1.新疆医科大学基础医学院生物学教研室（乌鲁木齐，830011）2.新疆医科大学基础医学院人体解剖教研室（乌鲁木齐，830011）

勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）是指持续或反复不能达到或维持足够的阴茎勃起完成满意的性生活，40～70岁之间的男性中，约52%患有不同程度的ED[1]，而我国男性ED的总患病率为26.1%，40岁以上男性的患病率为40.2%[2]。据WHO估计到2025年ED患者将达到3.2亿，并且ED的发病率呈逐年上升的趋势[3]。目前ED主要的治疗方法，包括5型磷酸二酯酶抑制剂、海绵体内药物注射和真空装置等[4]，但整体效果欠佳[5]，因此ED确切的发病机制和更有效的治疗方案亟待解决。ED作为男性常见性功能障碍疾病，他不仅以心血管疾病、糖尿病、高脂血症等重大疾病的伴发性疾病出现，同时也可以以ED这一独立疾病形式出现。目前针对前者研究较为深入，但是从环境因素出发，研究环境温度改变、环境植物雌激素对勃起功能的影响尚有不足，有待深入开展。故在前期工作中，我们通过模拟冷环境与雌激素样饮食的复合刺激条件建立了复合应激大鼠模型，对其性功能改变与勃起功能损伤进行了初步的研究，并成功筛选出了ED大鼠模型[6,7]。本研究，则在此基础上，进一步通过核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1HNMR）技术检测了复合应激ED大鼠模型血清代谢组变化和伊木萨克片的影响，探讨ED可能的机制与伊木萨克片的调控作用，现报道如下。

资料与方法

一、资料

（一）实验动物

选取正常雄性Sprag-Dawley（SD）大鼠150只，SPF级，6 周龄，体质量（200±10）g，性成熟雌性大鼠 20 只，2月龄，用于阿朴吗啡（apomorphine，APO）阴茎勃起实验和交配实验，均由新疆医科大学实验动物中心提供。实验动物适应性常规饲养1周，室温（20±2）℃，湿度40%～60%，自由饮水进食。

（二）主要实验仪器

600 MHz核磁共振波谱仪 （美国Varian公司），－80℃超低温冰箱（中国海尔公司），-20℃低温冰箱（中国海尔公司），Millipore水纯化系统 （美国 Millipore公司），低温台式超速离心机 （德国Eppendorf公司），BSA224S-CW型电子分析天平 （北京赛多利斯天平有限公司）。

（三）主要试剂和药材

阿朴吗啡 （批号：A4393-250MG，美国Sigma公司）；黄体酮（批号：120804，浙江仙琚制药股份有限公司，）；雌二醇（批号B130613，宁波市三生药业有限公司）；伊木萨克片（批号：20130501，规格：6 片×1 板 /盒，新疆和田维吾尔药业有限责任公司）；重水 （批号：20170605，美国 Cambridge isotop laboratories公司）；WG-1000-7型核磁管 （规格：5mm×177.8mm，美国Wilmadlabglass公司）；4，4-二甲基 -4-硅戊烷 -1-磺酸（DSS）、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、戊巴比妥纳、酒精、氯化钠、甲醛、无水乙醇均为国产分析纯试剂（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）。

二、方法

（一）复合应激ED大鼠模型的制备、分组及伊木萨克干预

150只正常雄性大鼠中，随机抽取30只为正常对照组（N组），余120只为造模组，按照文献[5,6]方法制备环境雌激素样饲料、发情雌鼠和复合应激ED大鼠模型，筛选ED大鼠模型后，随机分为复合应激ED大鼠模型组 （ED组，30只）和伊木萨克干预组 （Y组，30只）。Y组大鼠予以伊木萨克片每日灌胃1次（250mg/kg体质量），其余2组使用等剂量蒸馏水灌胃，干预2周。定期检测APO勃起功能和交配能力。

（二）血清样本采集

药物干预结束后，将所有大鼠称量，并用1%戊巴比妥钠腹腔注射 （40 mg/kg）麻醉。腹主动脉抽血20 mL，室温静置 2 h，3000×g离心10 min，分离血清，置-80℃冰箱保存。

（三）血清样品预处理

N组、ED组和Y组大鼠血清样品从低温冰箱中取出并在室温中解冻，每份取700μL，加入3KDa超滤管内，12000×g离心15 min，取上清液450μL加到5 mm的核磁管内，再加重水配制的DSS缓冲溶液50μL（浓度为5.17 mmol/L)、混匀。

（四）大鼠血清1H-NMR测定及数据处理

将N组、ED组和Y组大鼠血清核磁管置于600 MHz核磁共振波谱仪，进行1H-NMR检测。预饱和方式抑制水峰，脉冲序列为NOESYPR1D（RD-90-t1-90-tm-90-Acq）。测试温度25℃，饱和时间为2 s，单次扫描时间为1.636 s，谱宽10000 Hz，采样点数64 k，扫描次数为128次。使用MestRenova分析软件 （Mestrelab Research，Santiagode Compostella，西班牙）将核磁信号进行转换。以重水化学位移0.00 ppm单峰质子信号作为化学位移参考峰定标调整基线，得到一维氢谱图。将1H-NMR图谱在化学位移 δ9.0～0.5 ppm范围内以δ0.003 ppm积分区间进行分段积分，除去δ5.20～4.75 ppm之间的水峰积分值。导入SIMCA-P＋11统计软件（瑞典Umetries公司）进行偏最小二乘判别式法分析（partial least squares diseriminant analysis，PLS-DA）筛选3组之间的差异性代谢物；进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）得出每2组之间的差异性代谢物。参数R2X、R2Y表示OPLS-DA模型的拟合情况，Q2表示模型的可预测度，他们的大小直接反应模型的可靠程度，其值越接近1，代表模型拟合度越好，Q2＞0.4，则模型可靠。代谢物含量变化情况采用OPLS-DA分析中的变量相关系数r判断，r为负值，说明代谢物在实验组血清内的含量高于对照组，r为正值，表示血清代谢物在实验组的含量低于对照组，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、大鼠1H-NMR血清代谢物图谱指认

采用MestRenova分析软件对N组、ED组和Y组大鼠血清1HNMR图谱中主要代谢物成分信号进行了归属，指认出的主要代谢物成分有21个（图1），其化学移位、谱峰归属等详细信息见表1。

二、大鼠血清代谢物OPLS-DA模型拟合度分析

将1H-NMR图谱以OPLS-DA和PLS-DA方法进行模式识别分析，可得到3组大鼠血清代谢物1H-NMR图谱的二维散点图和三维空间分布图，图中每一个点代表1个变量。3组大鼠血清代谢物在分布图中分别落在不同区域，说明这些分散点中所包含的信息必定存在不同程度的差异。3组大鼠血清代谢物分布图（图2），R2X、R2Y 和 Q2分别为 0.627、0.482、0.41。 N 组和 ED 组大鼠血清代谢物分布图，R2X=0.45、R2Y=0.652、Q2=0.596（图3）。Y组和ED组大鼠血清代谢物分布图，R2X=0.524、R2Y=0.609、Q2=0.485（图 4）。 结果说明模型拟合度好，可靠程度高。

图2 三组大鼠血清代谢物PLS-DA 分析

图3 N组和ED组大鼠血清代谢物OPLS-DA分析

图4 ED组和Y组大鼠血清代谢物OPLS-DA分析

三、各组大鼠血清差异性代谢物分析

与N组比较，ED组大鼠血清中VLDL、亮氨酸、胆碱、谷氨酰胺、丙酮、缬氨酸、γ-氨基丁酸、丙酮酸、谷氨酸、柠檬酸、肌酸、牛磺酸、蛋氨酸、天冬氨酸表达量降低；乳酸、丙氨酸、乙酰乙酸、氧化三甲基胺、β-葡萄糖、胍基乙酸、β-呋喃糖表达量升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与ED组比较，Y组大鼠血清中乳酸、丙氨酸、氧化三甲基胺，β-葡萄糖、胍基乙酸、β-呋喃糖等表达量显著降低；VLDL和胆碱表达量显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05），其化学移位、谱峰归属等详细信息见表1。

表1 各组大鼠血清差异性代谢物

讨 论

应激是机体在各种内外环境因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应，又称为应激反应，它与糖尿病、高血压、高脂血症和肥胖症等代谢性疾病的发生发展密切相关[8]。越来越多的研究发现各种不同应激可诱导体内代谢水平发生改变，进而导致ED[9,10]。本团队前期研究采用环境雌激素样饮食联合冷刺激的干预方法成功建立了复合性应激ED大鼠模型，伊木萨克可显著改善ED大鼠的勃起功能[6]。本研究通过1HNMR检测此ED大鼠模型血清代谢组的变化，探讨其发病机制，并观察伊木萨克干预后对代谢组的影响。

本研究结果发现亮氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、缬氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和柠檬酸含量发生显著改变。亮氨酸和丙氨酸与蛋白质代谢相关，能减轻大鼠机体的消耗，改善缺氧状态；亮氨酸含量异常还可引发血管氧化应激，加重动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展[11,12]。谷氨酰胺是体内重要抗氧化剂牛磺酸的前体，维持组织中谷胱甘肽的储备、保护细胞、组织和器官免受自由基损伤，减轻应激反应，提高机体抗氧化能力[13]，参与动脉粥样硬化发展[14,15]。缬氨酸可抑制肿瘤坏死因子、血管黏附因子-1、超氧化因子-2和内皮型一氧化氮合酶等诱导的内皮功能紊乱[16,17]；其衍生物L-谷氨酸-缬氨酸抑制炎细胞因子和白介素-1、6、8的表达，并通过抑制上皮细胞中肿瘤坏死因子-α信号传导通路减轻炎症[18]，而炎症和内皮功能紊乱也是ED的重要诱因[19,20]。谷氨酸是一种兴奋性氨基酸，在炎症反应中有重要作用。当组织损伤时，影响到谷氨酸代谢，激活一系列兴奋性氨基酸受体，诱导炎症介质的释放，导致炎症[21,22]；谷氨酸还可诱导神经型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子-α、干扰素-Y、白介素-1β、一氧化氮和活性氧等引起氧化应激反应和血管内皮功能紊乱等[23,24]；而炎症、氧化应激反应和血管内皮损伤是ED常见的诱因[25,26]。γ-氨基丁酸可以通过拮抗谷氨酸的兴奋性毒性，减轻细胞损伤和凋亡[27]，还能减少耗氧量，而机体的缺氧状态与ED有着密切的关系[12,28]。蛋氨酸是琥珀酰辅酶A、同型半胱氨酸、半胱氨酸、肌酸和肉碱的前体，也是人体内最容易被氧化的必需氨基酸之一。蛋氨酸缺乏可导致心脏血管病变、睾丸病变等；还可通过调节谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化指标抑制氧化应激、抑制促炎细胞因子和核因子-κB活化来减少炎症[24,29]。柠檬酸、谷氨酸和谷氨酰胺都是三羧酸循环的中间代谢物，参与炎症代谢通路，与动脉粥样硬化有密切的相关性[30,31]。柠檬酸还具有降低内毒素引起的氧化应激的作用[14,32]。天冬氨酸含量变化与细胞凋亡、生长、分化炎症反应相关[33,34]。在细胞发生骨架破坏、缺氧或ATP耗竭时，引起氧化应激，进而导致细胞凋亡[35]，参与高血压、心肌细胞凋亡和动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展[12,36]。结果提示，ED组大鼠血清中亮氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、缬氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和柠檬酸含量改变可能是机体物质代谢紊乱的结果，通过参与氧化应激、炎症反应，进一步诱导内皮功能障碍和血管性病变，进而导致ED发生发展。

β-葡萄糖、β-呋喃糖、乳酸、胍基乙酸、肌酸均参与机体能量代谢和物质代谢。葡萄糖可无氧酵解生成乳酸并产生少量的三磷酸腺苷供给机体能量[37]。葡萄糖含量异常可造成线粒体功能紊乱，影响机体正常物质和能量代谢，导致细胞凋亡，促进动脉粥样硬化的发生发展[38]；血糖浓度增高还可以抑制血管舒张、导致血管壁钙化和功能障碍，而这些变化是ED的重要诱因[39,40]。呋喃糖含量增多，导致活性氧物质的产量增加，导致膜脂质过氧化，细胞结构损伤和凋亡[41]。呋喃糖还可通过毒性作用，导致促炎细胞因子的增多，参与炎症反应和内皮功能紊乱[42,43]，而炎症反应和内皮功能紊乱为ED的重要诱因[19,20]。乳酸能减轻机体的消耗，改善缺氧状态[11,12]。缺氧可使海绵体平滑肌细胞收缩表型减少和海绵体纤颤等海绵体微结构改变，进而引起ED[44]。乳酸还可影响血管的收缩、舒张，而阴茎血管的正常收缩、舒张是阴茎正常勃起的关键[45,46]。胍基乙酸在酶的催化作用下能够合成肌酸，肌酸被认为是一种能量缓冲剂[47]，能影响血浆二氧化碳含量，参与高碳酸血症，与阴茎海绵体组织损伤有关，肌酸还参与细胞凋亡和氧化应激，这些功能都与ED密切相关[48,49]。胍基乙酸还可生成超氧阴离子（氧自由基），产生活性氧，而超氧阴离子等氧化应激因子在ED中发挥着重要的作用[47,50]。我们的研究发现，复合应激ED大鼠血清中β-葡萄糖、β-呋喃糖、乳酸、胍基乙酸、肌酸含量显著变化，此变化涉及的能量和物质代谢紊乱可能通过诱导炎症、细胞凋亡、脂质过氧化和氧化应激反应，引起内皮功能障碍、血管舒张功能降低、海绵体微结构改变等导致ED。

本研究结果还发现，与血脂的运输和代谢密切相关的极低密度脂蛋白（VLDL）、丙酮、乙酰乙酸、丙酮酸、氧化三甲基铵（TMAO）和胆碱在复合应激ED大鼠血清中含量显著改变。VLDL堆积引起脂代谢紊乱可导致动脉粥样硬化、斑块形成和血管内皮功能障碍等[51,52]。而且VLDL与细胞增殖、细胞凋亡、炎症反应、血管内皮功能紊乱有关[19,20]。丙酮和乙酰乙酸均为酮体的组成部分。脂肪利用增加时，血中乙酰乙酸和丙酮等酮体浓度就会升高[53]，能诱导氧化应激，其中乙酰乙酸影响VLDL的含量，而氧化应激和VLDL代谢紊乱都能引起阴茎血管病变，进而参与ED的发生发展[25,26]。丙酮酸在糖、脂肪和氨基酸间作为枢纽互相转化，通过阻止超氧化物的形成防止氧自由基的产生，还可以与过氧化氢反应生成二氧化碳和水清除氧自由基，因此具有防止氧化损伤的作用[14,54]；丙酮酸还以丙酮酸盐的形式抑制肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6等炎症因子的释放，稳定血管内皮细胞，减少细胞凋亡，进而起到保护内皮细胞的作用，而氧化应激和内皮功能紊乱已证实是ED发病的重要机制[55,56]。TMAO是由富含胆碱、磷脂酰胆碱和左旋肉碱的食物经肠道微生物转化生成三甲胺，在肝酶和黄素单加氧酶的作用下生成，参与氧化反应、脂质代谢和炎症反应，增加患心血管疾病的风险[57,58]。胆碱是细胞膜结构及信号转导的重要成分，胆碱抗炎通路兴奋后可抑制促炎因子的产生和释放[59,60]。本研究结果提示VLDL、丙酮、乙酰乙酸、丙酮酸、TMAO和胆碱含量显著改变，可能与能量和脂代谢紊乱通过诱导炎症、氧化应激和内皮功能障碍导致ED发生发展。

综上所述，本研究采用1H-NMR检测复合应激ED大鼠模型血清代谢组变化，并观察伊木萨克片的干预效果。结果发现21种代谢物在复合应激ED大鼠模型血清中发生显著变化，其中14种代谢物含量下降，7种代谢物含量增高；经过伊木萨克片干预后，6种代谢物含量降低（乳酸、丙氨酸、氧化三甲基铵，β-葡萄糖、胍基乙酸、β-呋喃糖），2种代谢物（VLDL和胆碱）含量增高。此结果提示，复合应激ED大鼠模型出现能量和三大物质代谢紊乱，而伊木萨克片干预后可能通过改善机体代谢紊乱，进而抑制氧化应激反应和炎症反应引起的内皮功能障碍和血管病变等机制促进ED的恢复，但其具体的机制，尚需进一步研究。