脂肪来源干细胞促进糖尿病ED勃起功能恢复的实验研究

燕 浩 肖冬冬 荣立夺 成 欢 王雅梅 提运荣 张 明 隋晓锋 卢慕峻*

1.上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科（上海 200127）；2.东华大学化学化工与生物工程学院（上海 201620）

勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)是指阴茎持续不能达到或维持足够的勃起，以完成满意的性生活[1]。ED的病因错综复杂，内分泌、血管神经和精神心理等因素均会影响该病的发生和发展[2]。糖尿病是造成ED的常见病因之一，糖尿病患者ED发生率达到35%～90%[3]。目前ED的治疗手段，包括磷酸二酯酶抑制剂（PDE5I）、低能量冲击波治疗、经尿道给药和真空负压吸引，皆对糖尿病ED患者疗效不理想，而阴茎假体植入同样存在费用高昂、术后感染和机械故障等缺陷[4]。糖尿病ED复杂的发病机制和较差的疗效促使人们转向其他的治疗手段。

干细胞因具有自我更新能力和一定条件下的多向分化能力，其中脂肪来源干细胞（Adipose-derived stem cells,ASCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种多能干细胞[5]，其取材方便、来源广泛、对机体损伤小，并且拥有旁分泌和多向分化功能，被应用于各个组织器官的功能修复。本研究拟采用脂肪来源干细胞治疗糖尿病ED大鼠，评价其勃起功能及血管化程度，研究其改善勃起功能的机制。

材料与方法

一、材料

链脲佐菌素 （S0130，Sigma， 美国），柠檬酸钠（1613859，Sigma， 美国）， 柠檬酸 （791725，Sigma，美国），胎牛血清（10437028，Gibco,美国）。低糖 DMEM培养基 （21885108，Gibco， 美国）， 抗菌 -抗真菌剂（15240062，Gibco，美国），胰蛋白酶（T2600000，Sigma，美国），胶原酶（NB4，SERVA，德国），肝素钠注射液（国药集团容制药有限公司），磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（上海赛戈生物有限公司），DAPI（上海翊圣生物科技有限公司），Masson试剂盒（Solarbio，美国），多聚甲醛（16005，Sigma，美国），双蒸水（上海交通大学医学院附属第九人民医院），生理盐水（上海交通大学医学院附属第九人民医院），乙醇（上海交通大学医学院附属第九人民医院），兔抗大鼠CD31抗体（稀释 1：100，Servicebio）；BL420S 多通道生理记录仪（成都泰盟有限公司）

实验对象：4只2周龄和30只250g～300g经交配试验证明勃起功能正常的SD清洁级雄性大鼠，由西普尔-必凯公司提供。

二、方法

（一）大鼠ASCs的分离和提取

按Wang等[6]的方法，取同种异体近交系2周龄SD雄性大鼠，无菌状态下取大鼠腹股沟处的脂肪组织，放入PBS中洗净血污，再用抗菌-抗真菌剂清洗一遍后，转入新的培养皿中。将组织切剪成1mm×1mm的糜状物，加入消化液（0.075%胶原酶NB4，其余为DMEM)，移液器充分打匀，直到组织可以通畅的出入吸嘴。加入含有血清的培养基，混匀并分装入细胞培养瓶中，放入CO2培养箱中培养。间隔48h换1次液。细胞传代培养至第三代后，吸去培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞3次，加入0.25%的胰蛋白酶消化，显微镜下观察ASCs聚集成群后终止消化，放入离心管离心，弃去上清液重悬后，取细胞悬液100μL显微镜下计数得出细胞密度，按1：1的体积与PBS混匀，终密度调整为106/mL。

（二）实验分组

选取12周龄性成熟的30只雄性SD大鼠，随机分成3组（每组10只），A组为正常组（血糖正常的SD大鼠），B组为PBS组 （糖尿病ED大鼠单纯注射PBS治疗），C组为ASCs组 （糖尿病 ED大鼠海绵体注射ASCs治疗）。所有大鼠采用标准饲料喂养，自由采食和饮水，适应环境一周。

（三）糖尿病ED大鼠模型的构建

禁食过夜后，正常组在腹腔注射生理盐水，另外两组注射生理盐水溶解的链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）60mg/kg，自由采食和饮水。分别在给药后72h连续测3次随机血糖，然后每周测一次血糖和身高体质量直到12周实验结束。血糖连续＞16.7mmol/L可视为糖尿病[7]。

（四）阴茎海绵体内注射

建立起糖尿病ED模型并提取ASCs后，进行海绵体内注射（intracavernous injection,ICI）手术干预，将大鼠称量麻醉，暴露阴茎海绵体，ASCs组用微量注射器将200μL脂肪干细胞悬液从大鼠海绵体中部注射，留置5min确保细胞流入海绵体间隙。正常组和PBS组用微量注射器注射等量的生理盐水，同样留置5min确保流入海绵体间隙。注射完毕后放入笼中继续喂养，待12周后进行后续各项测试。

（五）海绵体内压（intracorporeal pressure，ICP）与平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）比值测定阴茎勃起功能

各组大鼠在治疗后饲养至12周进行勃起功能检测，将大鼠麻醉固定，腹部作一正中切口，暴露前列腺，在前列腺背侧寻找盆神经，然后通过神经剥离器将盆神经及阴茎海绵体神经分离出来。切开阴茎及其上方靠近腹部的皮肤，剪开包皮并剥离至阴茎脚位置，充分暴露阴茎海绵体；于左侧阴茎海绵体中部用25G规格的、充满肝素溶液的静脉输液针进行穿刺，进针的角度约为10°到20°，防止角度过大刺入尿道，若输液针的导管有回血，证明穿刺成功，穿刺完毕后固定输液针，另一侧通过压力换能器连接B420S生物信号记录仪输入信号接口，准备测量阴茎海绵体内压。随后切开颈部皮肤，暴露左颈动脉，将左颈动脉与周围组织及神经分离，结扎远心端，动脉夹夹闭近心端后，作一楔形切口，并将充满肝素溶液的P50导管置于动脉中，然后固定导管，另一侧通过压力换能器连接B420S生物信号记录仪的输入信号接口，以监测全身的平均动脉压。准备完毕后开始进行电刺激，将不锈钢电极连接B420S生物信号记录仪的输出信号接口，将刺激参数设置为5V，20Hz，5ms脉冲宽度和50s持续时间，开始刺激大鼠的阴茎海绵体神经，同时记录ICP和MAP，在每只大鼠中记录最大ICP与MAP的比率（ICP/MAP）。

（六）Masson染色

取阴茎中段组织，用4%的多聚甲醛固定过夜，然后用乙醇梯度脱水，包埋在石蜡中，切成4μm厚的薄片，按Masson试剂盒说明书进行染色。用image-J进行分析，每个切片随机选取6个区域。

（七）免疫荧光染色

选取阴茎中段海绵体2mm组织，用4%的多聚甲醛固定4℃过夜，之后转移到30%蔗糖PBS溶液4℃过夜，储存在-80℃，切成10μm冰冻切片，3%的牛血清白蛋白PBS溶液（BSA）室温孵育20min，然后孵育抗CD31抗体抗体。用image-J进行分析，每个切片随机选取6个区域。

三、统计学处理

使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示。各组数据比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、大鼠的血糖及体质量变化

正常大鼠血糖始终保持稳定，而糖尿病组大鼠的血糖明显升高，ASCs组则在升高后出现了一定程度的降低，其最终血糖显著低于PBS组（P＜0.05）；PBS组最终体质量相较于正常显著降低，ASCs组体质量也有一定程度的降低，但其最终体质量与PBS组相比明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），表 1。

表1 3组大鼠体质量血糖数据

二、大鼠阴茎海绵体组织Masson染色

PBS组的平滑肌/胶原比例显著低于正常组（P＜0.001），ASCs组平滑肌/胶原纤维比例较PBS组增高（P＜0.001），差异有统计学意义。

图1 3组大鼠的Masson染色结果

三、阴茎海绵体压力测定（ICP/MAP）评价勃起功能恢复

ICP/MAP结果显示，ASCs组ICP/MAP为（0.6896±0.0260），较 PBS 组（0.3724±0.0137）显著升高(P＜0.001)，图2。

四、免疫荧光

CD31荧光显示PBS组血管数量（14.50±3.56/mm2）相对正常组（39.33±10.86/mm2）明显降低（P＜0.001），而ASCs组血管数量 （34.00±1.19/mm2） 显著高于PBS组（P＜0.001），图 3。

图2 3组大鼠海绵体内压和平均动脉压结果

图3 大鼠阴茎CD31免疫荧光染色结果

讨 论

糖尿病是ED常见的病因之一，其发病机制复杂。有学者认为糖尿病损害了阴茎的内皮细胞和平滑肌细胞的结构功能。而阴茎血管内皮细胞的功能和平滑肌细胞数量的稳定对于维持阴茎的勃起功能十分关键。阴茎勃起过程本质上是一种神经血管活动，但其受各种心理和生理因素的影响。当人受到一定的性刺激时，下丘脑或骶髓低级中枢会发出冲动，神经冲动传至阴茎海绵体，在副交感神经神经末梢释放的神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）和内皮细胞释放的内皮型一氧化氮合酶 （endothelial nitric oxide synthase,eNOS）的催化下，一氧化氮（nitric oxide,NO）的合成释放明显增多，NO进入平滑肌细胞内，激活鸟苷酸环化酶（guanylyl cyclase,GC），使平滑肌细胞内的环磷酸鸟苷 （cyclic guanosine monophosphate,cGMP）增多，从而导致细胞内钙离子浓度降低，平滑肌细胞舒张，动脉血流量增加，阴茎海绵体膨大变硬从而产生勃起。由于PDE5I依赖上述过程的完整性，一旦内皮细胞和平滑肌细胞功能受损，PDE5I的作用将会受到限制，因此，学者尝试采取各种手段对糖尿病引起的阴茎损伤进行修复。

随着干细胞在组织工程领域研究的深入，目前已有多种干细胞用于各类组织器官修复的研究报道，如骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪源性干细胞(ASCs)和肌源性干细胞(MSCs)等[8]。ASCs主要通过旁分泌和多向分化两种方式进行组织再生修复，其多向分化潜能主要体现在其可以分化成脂肪细胞[9]、骨和软骨细胞[10]、内皮细胞[11]和上皮细胞[12]等多种细胞。而其旁分泌作用主要体现在其可以分泌多种细胞因子，在促进血管化、趋化作用和调节免疫中发挥了重要作用。其分泌的促血管的细胞因子包括血管活性生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF），脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）， 成纤维细胞生长因子等[13,14]。由此可见ASCs在治疗糖尿病ED方面有着巨大的潜能。

本研究成功建立糖尿病ED大鼠模型，并从大鼠腹股沟脂肪分离脂肪源性干细胞进行阴茎海绵体注射治疗。通过大鼠的海绵体测压，以及对海绵体组织切片进行Masson染色和CD31免疫荧光染色，我们发现ASCs具有促进糖尿病ED大鼠勃起功能恢复的潜力。其中PBS组的ICP/MAP及血管数量较正常组显著降低，而ASCs组的ICP/MAP显著高于PBS组，证明糖尿病大鼠经ASCs海绵体内注射治疗后，勃起功能得到一定程度的改善。而其海绵体组织的平滑肌数量和血管数量也得到了一定程度的提升，我们推想ASCs能够促进海绵体组织的血管化，提升糖尿病大鼠海绵体的血管密度，保护海绵体的内皮细胞和平滑肌细胞，从而改善勃起功能。根据我们的前期研究[15]，ASCs能通过旁分泌作用促进SDF-1/CXCR4通路改善膀胱组织的血管化，因此，ASCs可能在海绵体组织局部旁分泌某些生长因子，激活通路传导、促进血管化，延长平滑肌细胞和内皮细胞的存活时间，从而改善勃起功能。Maarten等的[16]研究也表明，干细胞治疗ED的相关机制并不是直接分化为血管内皮细胞或平滑肌细胞，而是通过旁分泌的方式，相关机制有待进一步深入研究。

本研究通过大鼠糖尿病ED动物模型建立，以及海绵体注射ASCs治疗糖尿病ED，初步发现ASCs能够通过促进阴茎海绵体血管及平滑肌再生，改善糖尿病大鼠的勃起功能，提示ASCs是潜在的糖尿病ED的治疗手段。