hsa-miR-500a-3p对前列腺癌早期诊断及病程判断的作用

顾佳宇 汪 洋 冯杨焜 冯宁翰

南京医科大学附属无锡第二医院（江苏无锡 214002）

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一，发病率随着年龄的增长而升高，且呈现出地区差异性[1-2]。我国前列腺癌的发病率虽较欧美地区低，但随着人口老龄化进程的加快和饮食结构的改变，其发病率逐年上升，呈现出恶性程度高、预后差等特点[3-4]。高通量测序被广泛应用于小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。随着科学技术的进步，人们对环境中微生物的探索也从未终止过。微小RNA(miRNA)是一类高度保守内源性非编码的小核苷酸序列，近年miRNA所介导的基因转录后调控的研究成果，为前列腺癌发病机制及早期诊断的研究开辟了新的思路，研究也报道称多种miRNA可能参与前列腺癌的发生发展过程[5-6]。其中miR-500a-3p的研究表明其在前列肝癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中表达上调，作为一类癌基因，影响前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力[7-8]。本研究采用RT-PCR检测前列腺癌、良性前列腺增生及正常患者血清中miR-500a-3p的表达水平，为前列腺癌的早期诊断提供实验依据。

材料与方法

一、研究对象

以2017年9月至2018年7月在我院泌尿外科诊治的前列腺癌、良性前列腺增生患者中采用随机数表法各选择30名作为研究对象，年龄（53.6±7.2）岁，所有前列腺癌及良性前列腺增生患者经穿刺活检病理学确诊且抽血前未经任何治疗;排除患有高血压、急性感染、结核病及糖尿病等疾病的患者。前列腺癌的病理分级依据2003年WHO前列腺癌病理组织学分类标准的Gleason评分，肿瘤分期按Jewett-Whitmore-Prout分期标准(即ABCD分期)。所有患者及家属签署知情同意书，并通过了医院伦理委员会的审批。

二、试剂与耗材

microRNA抽提试剂盒；4S Red Plus核酸染色剂（BBI A606695）；琼脂糖。第一链cDNA合成试剂盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase）(Thermo Scientific.EP0733)SW-CJ-1D洁净工作台 （江苏苏洁净化设备厂）；HC-2518R高速冷冻离心机（安徽中科中佳仪器有限公司）；DYY-6C型稳压稳流电泳仪（北京六一）；H6-1微型电泳槽 （上海精益有机玻璃制品仪器厂）；FR980凝胶成像系统（上海复日科技有限公司）；SMA4000微量分光光度计（merinton）；PCR反应扩增仪（BIO公司）；移液器（范围 100-10001，20-2001，0.5-101）（加拿大BBI公司）；LightCycler480 II（Rotkreuz,Switzerland）。

三、高通量测序

由BGISEQ-500测序技术进行测序，参考Homo_sapiens （人：NCBI_GRCh38） （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）数据库对测序结果进行整理。通过把测序得到的RNA数据与22版本的miBase数据库（http：//www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl）里面的已知miRNA进行比对，基于比对结果对相关的miRNA进行定量分析。已知miRNA的比对分析分为两种情况，一是miRBase数据库里面有收录这个物种的miRNA时，我们把测序数据与这个物种的miRNA进行比对；另一种情况是miRBase数据库里面没有这个物种的miRNA时，我们选择某些物种的miRNA与基因组进行比对，把能比对上的miRNA当作这个物种的已知miRNA来分析。

四、RNA提取

这里用来提取总RNA的是柱式microRNA抽提试剂盒产品编号：B518811

组成 50次miRNAExtractor 60ml RPE Solution 12ml RNase-free water 5ml Spin Column TR with Collection Tube 50套Spin Column MR with Collection Tube 50套

保存方法及注意事项：试剂盒于常温运输，冷藏（2-8°C）避光保存，有效期见包装。 miRNAExtractor是强腐蚀性物质，操作过程中应穿上实验服，戴好乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮肤或眼睛后，请立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

试剂准备：自备试剂：无水乙醇、氯仿等。

a.按瓶身标签说明在RPE Solution中加入4倍体积的无水乙醇，混匀后在瓶身做好标记。于室温密封保存。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持RPE Solution中的乙醇含量。若RPE Solution由于运输或保管不当造成容量不准，请用量筒定容后再加入相应体积的无水乙醇。

b.RNase是导致RNA降解最主要的物质，广泛存在于人的皮肤上和体液及环境中，因此制备RNA时必须经常更换手套，同时戴上一次性口罩和卫生帽，并保证仪器及环境清洁。

c.样品保存：匀浆后，加氯仿前，样品可在-70°C放置一个月以上；提取的RNA样品可以在70%酒精中-20°C保存2个星期以上；如果需要长期保存，请于超低温冰箱中保存。

样品准备：取 0.3 ml冻融的血清，加入 500 μl RNase-free Water悬浮沉淀，10,000 rpm 离心 2 min，弃上清，加入1 ml miRNAExtractor，充分振荡混匀。

提取步骤：

1.将裂解后样品或匀浆液室温放置5-10 min，使得核蛋白与核酸完全分离。

2.加入0.2ml氯仿，剧烈振荡30sec，室温放置3min。12,000 rpm 4°C离心10 min。如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2分钟。样品会分成三层：上层水相，中间层和下层有机相。RNA在上层水相中。

3.吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入1.5倍体积无水乙醇 (如540 μl上清液需加入810 μl无水乙醇)，混匀。不要吸取任何中间层物质，否则会出现基因组DNA污染。加入无水乙醇后，可能会产生半透明纤维状悬浮物，不影响提取和应用。

4.将吸附柱（Spin Column TR）放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加至吸附柱中，静置1 min，12,000 rpm离心2 min，倒掉收集管中废液。吸附柱最大有效体积为750 μl，如果混合液较多，可分两次转移至吸附柱。

5.将吸附柱（Spin Column TR）放回收集管中，加入500 μl RPE Solution，静置 2 min，10,000 rpm 离心 30 s，倒掉收集管中废液。RPE Solution使用前需检查是否按比例加入无水乙醇。

6.重复步骤5，一次。

7.将吸附柱 （Spin Column TR）放回收集管中，12,000 rpm离心2 min。此步骤是将吸附柱中残留的漂洗液去除，离心后将吸附柱室温放置2 min以充分晾干，以免残余的乙醇影响后续实验。

8.将吸附柱放入干净的1.5 ml离心管中，在吸附膜中央加入 30 μl RNase-free water， 静置 2 min，12,000 rpm离心2 min，将所得到的RNA溶液置于-70°C保存或用于后续试验。RNA在-70°C保存，以防降解。不要使用小于30μl的洗脱液进行洗脱。

五、定量PCR检测

按照ABI公司的TaqMan.MicroRNA Reverse Transcriptionkit试剂盒操作说明书，对抽提的RNA进行体外反转录实验，得到cDNA产物；反应条件为：16°C，孵育 30 min，42°C 孵育 30 min，85°C 加热 5 min，4°C 保存。以得到的cDNA为模版，进行荧光定量PCR，采用TaqMan.Universal PCR Master Mix20μl反应体系，在罗氏LightCycler480仪器上操作，以U6作为表达检测的内参，ΔCT表示 miR-500a-3p的相对表达，其中ΔCT=|CTU6-CTmiR-500a-3p|，反应条件为：95°C，预变性 10 min；95°C 15 s，60°C 30 s，70°C 30 s进行 40 个循环的扩增，引物信息见表1。

表1 各引物序列信息

六、统计分析

本研究中的数据全部采用SPSS21.0统计软件分析进行分析，其中计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用T检验进行统计分析，多组比较分析采用单因素方差分析进行，以P＜0.05作为数据有统计学差异的判断标准。

结 果

一、测序结果

在前列腺癌中特异高表达的基因有：hsa-miR-500a-3p，hsa-miR-7854-3p。

图 1 hsa-miR-500a-3p（图 1a）和 hsa-miR-7854-3p（图 1b）在正常前列腺、增生前列腺和前列腺癌组织中表达

相比于前列腺癌，在正常人与前列腺增生中高表达的基因有：hsa-miR-584-3p，hsa-miR-4725-3p。

图 2 hsa-miR-584-3p（图 2a）和 hsa-miR-4725-3p（图 2b）在正常前列腺、增生前列腺和前列腺癌组织中表达

二、血清miR-500a-3p的表达水平分析

对各组患者血清中miR-500a-3p的表达水平进行比较。结果显示，miR-500a-3p在前列腺癌患者血清中的表达水平较良性前列腺增生及正常人血清显著升高，且良性前列腺增生组血清中的表达量亦较正常组高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 各组血清中miR-500a-3p的表达比较*P＜0.05

三、血清miR-500a-3p的表达与临床病理参数的相关性分析

单因素方差分析和t检验结果显示，前列腺癌患者血清中miR-500a-3p的表达在G1期平均为1.26±0.22，G2期平均水平为1.82±0.46，G3期平均水平为 2.53±0.71，三组两两相比差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步比较发现G1期患者血清中miR-500a-3p的表达显著低于 G3期患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；Jewett-Whitmore-Prout临床分期不同分期患者血清中miR-500-3p的表达水平差异显著（P＜0.05），并且随着分期的不断加重，miR-500a-3p的表达水平也逐渐升高；对有发生骨转移的患者，其miR-500a-3p的表达水平显著高于未发生骨转移的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；血清tPSA水平高于10 μg/L的患者，其miR-500a-3p的表达水平显著高于血清tPSA水平低于10 μg/L的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；而不同年龄组患者，血清中miR-500-3p的表达差异无统计学意义（t=0.535，P=0.596)，见表 2。

讨 论

前列腺癌是发生于前列腺腺体的恶性肿瘤，在老年男性人群中发病率高，严重威胁患者的生命健康，给家庭和社会带来了沉重的压力[9]。随着研究者对前列腺癌发病机制研究的深入，前列腺癌的诊断方法不断改进，如酸性磷酸酶的测定、前列腺特异性抗原筛查等为前列腺的早期诊断、早期治疗提供了可靠的方法[10]。MicroRNA作为宿主基因在细胞核内转录前体转录本，在细胞质内通过招募相关蛋白组成沉默复合体RISC与靶MicroRNA互补结合，降解或抑制mRNA，在转录后水平调节靶基因的表达[11]。虽然miR-500a-3p在肿瘤、炎症中的作用机制尚未完全清楚，但与细胞因子存在着密切的联系，研究发现其能够通过调控NF-kB通路抑制IL-6、IL-1β及TNF-α等细胞因子的表达，能够参与乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[12]。本研究显示在前列腺癌患者血清中miR-500a-3p的表达水平要显著高于良性前列腺病变及健康对照组患者，提示miR-500a-3p可能参与前列腺癌的发生发展过程，为前列腺癌的早期诊断提供相关实验依据。

表2 血清中miR-500a-3p表达与临床指标的关系

多项研究表明miR-500a-3p在肝癌、乳腺癌等多种实体肿瘤中的表达上调。Jiang等对肝癌患者的研究发现，miR-500a-3p在肿瘤患者癌组织中高表达，提高肿瘤细胞的肝细胞活性，与肝癌的发生发展密切相关；进一步分析其可能通过参与调控JAK/STAT3信号通路，在肝癌中发挥生理功能[12]。Vasily等在乳腺癌中研究miR-500a-3p的表达发现，miR-500a-3p表达与ER阳性的乳腺癌患者的预后密切相关，高表达miR-500a-3p的患者，其预后恢复效果越差[13]。廖等对前列腺癌患者血清中的miRNA研究发现，miR-141在前列腺癌患者血清中表达上调，或可作为前列腺癌患者早期诊断、分期以及预后的判断指标[14]。姚等通过定量PCR对前列腺癌患者血清以及组织，前列腺良性增生患者以及健康对照组进行研究发现，miR-15a在前列腺患者血清与组织中均显著低表达，可能参与前列腺癌的发生发展，与临床分期以及转移密切相关[15]。

本研究结果显示在前列腺癌患者血清中miR-500a-3p的表达水平显著升高，并且miR-500a-3p的表达水平与前列腺癌患者疾病的不同病理分期、临床分期、有无骨转移有关以及血清tPSA水平密切相关（P＜0.05），表明miR-500a-3p的血清表达水平与前列腺癌的病理分期存在一定的相关性，提示血清miR-500a-3p可能是前列腺癌进展的潜在生物标志物。

综上所述，miR-500a-3p在前列腺癌患者血清中的表达水平发生了显著改变，提示其可能在前列腺癌的发生发展过程中有重要的作用，为前列腺癌的早期诊断及病程的判断提供了相关实验依据，但是其具体的分子机制以及作用靶点还需要进一步研究。