双歧杆菌联合化疗对胃癌患者肠道菌群及临床症状的影响

郑家雷 莫缓缓 杨杨 苏方 方向 孙国平

1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科（安徽蚌埠233003）；2中国科技大学附属第一医院老年消化科（合肥233001）；3安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科（合肥230022）

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康。近年来，随着幽门螺杆菌的根除和人们良好饮食习惯的形成，胃癌的发病率有所下降；但发病率仍高居全球肿瘤第四位，病死率位居第三位［1-2］。我国是胃癌高发国家之一，中国癌症数据（2015年度）报告指出，我国每年胃癌预估新发病例近70万，死亡病例约50万，发病率和病死率在恶性肿瘤中均高居第二位［3］。化疗不仅能够有效提高进展期胃癌患者的治愈率和生存质量，而且能延长患者的生存期［4］；但是作为胃癌常见的化疗药物铂类是是高致吐药物，发生消化道不良反应的机率极高；常见的的临床症状，如恶心呕吐、腹胀、便秘及腹泻等明显影响到患者的生存质量，甚至影响化疗进程。近年来研究认为化疗所致的这些消化道不良反应可能与失调的肠道菌群有密切联系［5］。因此，在胃癌患者的化疗方案中能否通过加入益生菌调节肠道菌群数量变化，减少化疗药物所致的胃肠道不良反应，目前此类研究较少见。本研究通过对进展期胃癌患者化疗前后肠道主要菌群数量的变化以及化疗后生存质量、营养状况和不良反应进行观察和分析；探讨双歧杆菌对进展期胃癌患者化疗后的肠道菌群数量、生存质量、营养状况和不良反应的影响。

1 对象与方法

1.1研究对象选取2015年7月至2017年6月于蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科收治的82例中晚期胃癌患者作为研究对象。纳入标准：（1）年龄≥18岁且≤75岁；（2）所有患者均经病理及临床确诊的进展期胃癌患者；（3）初诊拟行化疗，既往未行手术及化疗；（4）入选前1个月内未使用过益生元、益生菌和抗生素；（5）粪便常规检查无异常，且无肠道菌群紊乱症状如腹胀、腹泻。排除标准：（1）既往曾行手术及化疗；（2）有肠道菌群紊乱症状如腹胀、腹泻；（3）1个月内使用抗生素；（4）有免疫系统疾病、糖尿病、肥胖等代谢疾病者；（5）伴有严重心脑血管疾病、全身多脏器功能衰竭及严重感染性疾病不能耐受化疗者。

1.2研究分组纳入研究对象根据随机数字表随机分为对照组42例及观察组40例。对照组患者使用FOLFOX6化疗方案，具体方案为：奥沙利铂85 mg/m2静脉滴注 2 h，d1；亚叶酸钙 200 mg/m2，静滴2 h，d1-2；亚叶酸钙结束后即刻5-FU 400 mg/m2，静脉推注，d1；5-FU 2.4 g/m2，微量泵持续静推46 h，d1-2。2周方案，2周期后疗效评估（准确记录滴注开始和结束时间、药物、药量等）。化疗期间均予常规止吐等对症治疗。观察组患者予以对照组同样化疗并口服双歧杆菌三联活菌胶囊（上海信宜药厂有限公司）至化疗结束停止；双歧杆菌三联活菌胶囊用法用量参照说明书予以2粒，口服，2次/d。所有患者均接受至少2个周期化疗。

1.3主要试剂及仪器主要试剂：大便基因组提取试剂盒（TIANGEN）、Taq plus PCR Master-Mix、SYBR Green I Mastex、引物合成（上海生工）。主要仪器：紫外分光光度计（日立公司），实时定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）、低温高速离心机（德国Eppendorf公司）、电子天平（国产）、移液器（德国Eppendorf公司）。

1.4研究方法（1）标本采集：所有研究对象化疗前后均使用无菌冻存管留取中段粪便1次，3 g以上，冻存于-20℃冰箱。（2）大便标本DNA提取：取0.5 g粪便，使用北京天根生化科技有限公司的细菌DNA提取试剂盒提取粪菌DNA。提取的大便菌群DNA继续放入-20℃冰箱内冻存。（3）引物设计与合成：参照既往文献和相关报道，应用Gene Bank数据库比对，筛选出特异性强的引物信息，由上海生工生物公司合成，见表1。（4）待测大便样品：16S rDNA的定量分析，提取的粪菌的DNA分别进行6种细菌的16S rDNA荧光定量PCR，每次实验同时设ddH2O代替DNA模板的阴性试验和标准品校正，每个样品均同时做2个平行复孔。（5）反应体系及扩增条件：优化反应体系及扩增条件，进行SYBR Green为荧光染料的实时定量PCR。见图1。

表1 肠内6种目标菌群的特异性引物序列Tab.1 Sequences of specific primers for seven target intestinal flora

1.5统计学方法数据输入SPSS 16.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差表示，应用两独立样本t检验法比较组间差异；计数资料用例数表示，应用χ2比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1纳入研究病例的一般资料对照组及观察组在性别比例、年龄、体质量指数、家族史等基线资料间差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

图1 荧光定量PCR溶解曲线Fig.1 Fluorensece quantitive PCR dissolution curve

2.2 双歧杆菌对胃癌患者化疗前后肠道菌群的影响对照组胃癌患者化疗后肠道粪便中双歧杆菌及乳酸杆菌数量明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05），而拟杆菌菌数量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；肠杆菌、肠球菌及葡萄菌组间差异无统计学意义。见表3。

表2 纳入研究病例的一般资料Tab.2 General Information of subjects included in study x±s

观察组胃癌患者化疗后肠道粪便中双歧杆菌、乳酸杆菌数量较前增加，差异有统计学意义（P＜0.05），而葡萄球菌数量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；肠杆菌、肠球菌及拟杆菌组间差异无统计学意义。见表3。化疗后观察组胃癌患者大便中双歧杆菌及乳酸杆菌数量较对照组明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），而拟杆菌及葡萄球菌数量明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 双歧杆菌对胃癌化疗患者肠道菌群的影响Tab.3 Influence of bifidobacterium on intestinal flora in patients with gastric cancer undergoing chemotherapy x± s，LogN/g湿便

2.3 双歧杆菌对胃癌患者化疗疗效的影响在化疗疗效方面，化疗后观察组40例胃癌患者中4例完全缓解，13例部分缓解，14例稳定，9例进展，近期有效率（CR+PR）为42.5%；对照组42例胃癌患者中3例完全缓解，13例部分缓解，16例稳定，10例进展，近期有效率（CR+PR）为38.1%；两组间有效率的差异无统计学意义（P＜0.05）。

2.4 双歧杆菌对胃癌患者化疗后不良反应的影响在消化道不良反应方面，化疗后观察组胃癌患者食欲减退、腹胀、腹泻及便秘的发生率均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。两组间恶心、呕吐及腹痛组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。观察组未出现3级以上呕吐及腹泻，而对照组分别有3例。

2.5 双歧杆菌对胃癌患者化疗后实验室指标的影响化疗后观察组胃癌患者肝功能损害、前白蛋白减少及大便隐血的发生率均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；但两组间白细胞减少、贫血、血小板减少及白蛋白减少的发生率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

2.6 双歧杆菌对胃癌患者生存质量及营养状况的影响化疗后观察组胃癌患者生存质量评分明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；化疗后观察组胃癌患者营养评估得分及营养不良的发生比例均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表6。

表4 双歧杆菌对胃癌患者化疗后胃肠道不良反应的影响Tab.4 Influence of bifidobacterium on gastrointestinal adverse reaction with gastric cancer undergoing chemotherapy例

表5 双歧杆菌对胃癌患者化疗后实验室指标的影响Tab.5 Influence of bifidobacterium on laboratory indicators with gastric cancer undergoing chemotherapy 例

表6 双歧杆菌对胃癌患者化疗后生存质量及营养状况的影响Tab.6 Influence of bifidobacterium on quality of life and nutritional status with gastric cancer undergoing chemotherapy x±s

3 讨论

中国癌症数据（2015年度）报告显示我国胃癌新发病例和死亡病例均占全世界的40%以上［3］；由于早期胃癌诊断十分困难，大部分胃癌患者临床确诊时已处于中、晚期，目前国内新诊断胃癌患者90%左右为进展期［6］。以化疗、放疗、靶向治疗结合的综合治疗在一定程度可以延长患者生存期，改善其生活质量；另一方面可以提高进展期胃癌的治愈率［7］。铂类和5-FU等均是胃癌化疗的基础药物，且两者联合应用具有显著的协同作用，但是联合化疗的疗效和获益已达到一定极限［8］，因为胃癌联合化疗的不良反应，如腹泻、便秘、腹胀、骨髓抑制及恶心呕吐等，轻则影响患者生存质量、加重或导致营养不良，重则影响到患者化疗进程甚至危及生命［9］。

肠道内益生菌群在体内具有潜在抑制结直肠癌发生、发展的作用［10-11］。目前没有相关研究提示胃癌的发生、发展与肠道中的某特定菌群有直接或间接的关系，但有研究［12］认为健康受试者大便菌群与胃癌患者有差异，说明化疗前胃癌患者的肠道菌群已属紊乱状态。STRINGER等［13］研究发现接受不同化疗方案出现胃肠道不良反应的不同恶性肿瘤患者的粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌的数量均明显下降。本研究也发现，化疗后的对照组双歧、乳酸杆菌的数量减少，而拟杆菌数量上升，表明FOLFOX6方案可抑制胃癌患者肠道有益菌群的生长，促进条件菌群的生长，导致肠道菌群紊乱加重。而陈春华等［14］的研究结果显示，失调的肠道菌群会导致腹泻、呕吐、恶心等并发症，甚至会出现严重的肠菌移位感染，常规的止吐及止泻治疗效果有限。但本研究结果显示两组间恶心、呕吐及腹痛的发生率差异无统计学意义，且观察组未出现3级以上呕吐及腹泻，而对照组分别有3例。提示胃癌使用FOLFOX6方案化疗同时额外补充益生菌能减少3级以上消化道不良反应发生的趋势，此结论有待扩大样本量进一步证实。

本研究在观察组胃癌患者化疗过程中全程予以双歧杆菌乳杆菌常规剂量口服；化疗后观察组患者肠道粪便中双歧杆菌较化疗前有所升高，葡萄球菌则明显降低；且观察组的双歧杆菌、乳酸杆菌明显高于对照组，而拟杆菌及葡萄球菌数量则明显减少。研究结果显示补充外源性双歧杆菌乳杆菌能够纠正胃癌患者化疗所致的肠道菌群失调，提示对胃癌患者化疗所致的肠道菌群紊乱具有预防作用。双歧杆菌是一种具有抗肠道酶类消化和抗胃酸作用的重要益生菌，通过其细胞壁黏附于肠黏膜上皮细胞，并调节肠道黏膜免疫反应；一方面维护了肠黏膜稳定的屏障功能，另一方面保证肠黏膜通透性处于正常水平［15］。许春进等［12］在胃癌患者化疗过程中加用益生菌，可纠正肠道菌群紊乱，降低消化道不良反应的发生率，且未增加明显其他不良反应。

本试验在胃癌患者化疗全程中常规剂量口服双歧杆菌乳杆菌，在消化道不良反应方面，化疗后观察组患者食欲减退、腹胀、腹泻及便秘的发生比例明显低于对照组；提示胃癌患者化疗全程中额外补充口服双歧杆菌三联活菌胶囊可通过调节肠道菌群失调降低化疗所致的消化道不良反应。在生存质量及营养状况方面，化疗后观察组胃癌患者生存质量评分、营养评估得分及营养不良的发生比例均明显高于对照组。因此，胃癌FOLFOX6化疗过程中辅以双歧杆菌可以减少患者胃肠道不良反应，改善患者的生存质量；并且可以提高患者对化疗的耐受性，促进患者完成化疗周期。MARTIN等［16］研究认为增加肠道内益生菌双歧和乳酸菌数量，可促进肠粘膜屏障的恢复，通过增加益生菌群数量增强其抗炎作用，同时减少条件菌群如肠杆菌的数量降低内毒素的产量，从而减轻肝功能损害。本研究在实验室指标方面，化疗后治疗组胃癌患者肝功能损害、前白蛋白减少及大便隐血的发生率均明显低于对照组；提示双歧杆菌乳杆菌在胃癌患者化疗过程中可通过调节患者肠道菌群改善化疗导致的肝功能损害、前白蛋白合成以及肠道黏膜损伤。在生存质量及营养状况方面，研究结果显示化疗后治疗组胃癌患者的生存质量及营养评分优于对照组；考虑主要原因可能一方面与患者消化道不良反应减少而摄入增加有关，另一方面与肠道菌群紊乱的纠正有关，因为人体很多必须氨基酸的合成及脂质的吸收均与肠道菌群有关。

综上所述，本研究结果表明FOLFOX6方案可抑制胃癌肠道菌群的正常生长，进一步降低肠内益生菌群数量，加重益生和条件菌群的比例失调；口服双歧杆菌三联活菌胶囊可增加化疗过程中胃癌患者肠道内益生菌数量，降低条件菌数量，从而预防和纠正菌群失调。由于本实验样本量小，随访时间短、且未进行多中心临床研究，结果一定程度上存在偏倚，研究结论还待进一步重复验证。