早发性卵巢功能不全患者外周血CD3+HLA-DR细胞水平与卵巢储备功能的相关性

宗国霞 王威 夏宇跃 朱丽阳 区宇洁 林炳耀

广东省佛山市第四人民医院1妇科，2检验科，4药剂科（广东佛山528000）；3广州金域医学检验中心（广州510330）

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40岁之前由各种原因导致的卵巢功能提前衰竭，其导致患者闭经提前，血清的卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平升高，雌激素水平降低的一种综合征［1］。目前对于POI其发病机制并未明确。研究［2］发现，POI患者其外周血中存在多种T细胞亚群的改变。人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是由HLA基因复合体所编码的产物，其在免疫反应中起关键作用［3］。HLA-DR表达于多种淋巴细胞中，其中细胞表明HLA-DR阳性的T淋巴细胞是T淋巴细胞活化的重要标志。POI患者卵巢组织颗粒细胞中HLA-DR抗原异常表达［4］，但对于POI患者中外周血中T细胞的HLA-DR表达水平仍缺乏研究。本研究旨在探讨早发性卵巢功能不全患者外周血CD3+HLA-DR细胞的表达水平，并分析其与自身免疫及卵巢储备功能的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料选取于2017年3月至2018年10月于我院就诊的早发性卵巢功能不全患者共63例（POI组），纳入标准：（1）符合早发性卵巢功能不全的诊断标准［5］；（2）排除盆腔占位性病变；（3）排除盆腔炎症；（4）获得患者知情同意。排除标准：（1）因卵巢手术、化疗所致的卵巢衰竭；（2）合并免疫性疾病；（3）1个月内服用过激素、免疫抑制剂及其他抗肿瘤药物。选择于我院体检同期健康育龄女性（对照组）各例作为对照。健康育龄女性的纳入标准：年龄＜40岁，月经正常，无盆腔占位病变或其它恶性肿瘤，无合并妇科炎症或合并其它代谢、免疫性疾病。两组患者的同质性良好（表1）。

表1 两组患者的一般资料Tab.1 Comparison of general data between the two groups of patients ±s

表1 两组患者的一般资料Tab.1 Comparison of general data between the two groups of patients ±s

组别POI组对照组χ2/t值P值例数63 40年龄（岁）30.6±3.4 29.4±3.5 1.726 0.087初潮年龄（岁）13.7±1.7 13.6±1.9 0.278 0.782 BMI(kg/m2)22.3±2.0 21.9±1.6 1.066 0.289孕次（次）0.9±0.4 0.8±0.5 1.121 0.265

1.2检测指标和方法（1）记录两组女性的一般资料，包括年龄、初潮年龄、体质量指数（BMI），记录POI患者的病程时间。（2）CD3+HLA-DR细胞和相关免疫细胞检查：清晨空腹抽静脉血5 mL，离心分离外周血的淋巴细胞备测。采用PE-conjugated anti-HLA-DR和FITC-anti-CD3的同型单克隆抗体进行孵育，采用美国BD公司流式细胞仪检测CD3+HLA-DR抗原淋巴细胞的表达水平。采用同样的方法检测CD3+、CD4+、CD8+、的T细胞亚群，记录CD4+/CD8+的比例，相关试剂由广州金域检验公司提供。（3）采用罗氏电化学发光检测性激素六项［FSH、LH、T、P、E2和PRL、抗苗勒管激素（AMH）、抑制素A（INHA）、抑制素B（INHB）］的含量，相关试剂由广州金域检验公司提供。

1.3统计学方法采用SPSS 24.0分析数据。计量资料采用均数±标准差表示，两组比较采用t检验，计数资料采用百分比表示，比较采用χ2检验，两指标关系采用Spearman相关分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1两组患者的外周血CD3+HLA-DR细胞表达对比POI组的外周血CD3+HLA-DR细胞比例显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.001），见图1。

图1 两组的外周血CD3+HLA-DR细胞表达对比Fig.1 Comparison of peripheral blood CD3+HLA-DR cells expression between the two groups

2.2两组的免疫相关细胞的表达水平POI组外周血的CD3+和CD8+细胞表达水平显著高于对照组，而CD4+以及CD4+/CD8+的水平显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3两组的性激素和卵巢储备功能指标对比POI组性激素中的FSH、LH水平显著高于对照组，而T、P、E2和PRL显著低于对照组（P＜0.001）。而POI组的AMH、INHA和INHB水平均显著低于对照组（P＜0.001）。见表3。

表2 两组免疫相关细胞的表达水平对比Tab.2 Comparison of expression levels of two groups of immune-related cells ±s

表2 两组免疫相关细胞的表达水平对比Tab.2 Comparison of expression levels of two groups of immune-related cells ±s

组别POI组对照组t值P值例数63 40 CD3+（%）73.6±5.7 68.2±8.4 3.888＜0.001 CD4+（%）32.9±3.6 38.8±5.2 6.804＜0.001 CD8+（%）34.7±4.3 25.4±4.6 10.412＜0.001 CD4+/CD8+0.947±0.142 1.536±0.235 15.870＜0.001

表3 两组的性激素和卵巢储备功能指标比较Tab.3 Comparison of sex hormone and ovarian reserve function indicators between the two groups of patients ±s

表3 两组的性激素和卵巢储备功能指标比较Tab.3 Comparison of sex hormone and ovarian reserve function indicators between the two groups of patients ±s

指标FSH(U/L)LH(U/L)T(nmol/L)P(nmol/L)E2(pmol/L)PRL(ng/L)AMH（ng/mL）INHA（pg/mL）INHB（pg/mL）POI组（n=63）45.2±6.5 39.4±13.2 1.1±0.6 4.3±2.6 71.3±25.4 142.3±39.6 0.12±0.06 24.2±3.6 7.5±4.3对照组（n=40）14.2±7.4 18.5±9.6 1.7±0.5 16.5±6.8 376.8±87.2 252.4±63.8 5.3±2.2 37.3±10.4 53.6±17.7 t值22.347 8.659 5.267 12.864 26.178 10.818 18.731 9.189 19.823 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.4POI患者外周血CD3+HLA-DR水平与各项指标的关系POI中的外周血CD3+HLA-DR表达水平与CD3+、CD8+呈显著的正相关，与CD4+和CD4+/CD8+的水平呈显著的负相关（P＜0.001）；与性激素中的FSH、LH呈显著的正相关（P＜0.001），与P和E2呈显著的负相关（P＜0.001）；与卵巢存储功能中的AMH、INHA和INHB水平均呈显著的负相关（P＜0.001）。见表4。

3 讨论

POI与自然绝经不同，因卵巢功能障碍，直接导致育龄女性的不孕症［6］。POI最大特点是异常低水平的雌激素和高水平的FSH，这表明卵巢不再通过产生雌激素和发育受精卵来响应循环FSH，卵巢进而出现萎缩。研究［7］表明，免疫学机制在POI的病情进展中具有重要的意义。由于目前仍缺乏有效的指标预测病情的进展，HLA-DR是MHC-II类分子，其主要表达于多种淋巴细胞上，对于T细胞中HLA-DR的表达表明T细胞存在激活状态［8］，既往报道［4］显示卵巢细胞中的HLA-DR抗原的异常表达可能参与了POI的病理过程，本研究也发现POI组患者的CD3+HLA-DR细胞比例显著升高，与既往研究相符合，但POI患者外周血的CD3+HLA-DR细胞水平与自身免疫及卵巢存储功能仍未明确。

表4 POI患者外周血CD3+HLA-DR表达水平与各项指标的相关性分析Tab.4 Correlation analysis of CD3+HLA-DR expression levels in peripheral blood of patients with POI and various indicators

本研究初步结果显示了POI患者外周血的CD3+HLA-DR细胞水平显著高于正常对照组的妇女，HLA-DR是发挥抗原呈递作用的关键效应分子，因此外周血T细胞亚群的变化也反应了POI患者机体内存在T细胞介导的免疫损伤［9］。POI患者中其外周血的CD4+以及CD4+/CD8+的水平显著低于对照组，这也是反应机体出现T细胞介导的免疫损伤的重要表现。T细胞亚群中的辅助细胞和杀伤抑制细胞两者比例失调后可导致机体免疫状态抑制，POI患者其机体存在着细胞免疫功能紊乱的状态。CD8+T细胞的分化和效能增加，促进了卵巢诱发自身免疫应答，从而导致颗粒细胞凋亡，也加快了卵巢闭锁。相关性分析的结果也显示了CD3+HLA-DR细胞水平与CD3+、CD8+呈显著的正相关，与 CD4+和 CD4+/CD8+的水平呈显著的负相关，这表明了细胞机体内的CD3+HLA-DR细胞水平能显著反应机体的细胞免疫应答状态。

POI组的卵巢储备功能指标中AMH、INHA和INHB水平均显著低于对照组。本结果发现了CD3+HLA-DR与卵巢存储功能中的AMH、INHA和INHB水平均呈显著的负相关。表明CD3+HLADR参与了调节了POI患者的性激素水平变化和影响了卵巢存储功能。POI的基础是由T细胞调节改变引起的细胞介导的自身免疫反应。其机制可能为活化状态的T细胞加速了对卵巢颗粒细胞的免疫应答，介导卵巢颗粒细胞的损伤。AMH是转化生长因子中的一种亚型，在卵泡部位分泌并表达，对卵泡发育起至关重要的作用［10］，而INHA和INHB主要由卵巢颗粒细胞分泌，当活化T细胞介导卵巢颗粒细胞的损伤后，导致卵巢颗粒细胞AMH、INHA和INHB的减少。这就显示了CD3+HLA-DR是调节卵巢储备功能和性激素水平的重要T细胞亚群。对于T细胞活化介导卵巢颗粒细胞损伤的机制仍需要进一步需要细胞和动物实以验证POI患者外周血CD3+HLA-DR细胞水平与卵巢储备功能的相关性。

本研究为单中心研究，仍需纳入更多病例和指标进行综合分析。综上所述，早发性卵巢功能不全患者外周血CD3+HLA-DR细胞水平与自身免疫功能、性激素水平具有密切的关系，与卵巢存储功能呈显著的负相关。