伴与不伴糖尿病肾病的糖尿病视网膜病变患者血浆蛋白质组学研究

李志琛 刘颖 何徐军 梅伟群 陈建斌 张华北 欧阳建 钱佳丽

1解放军第903医院内分泌科（杭州 310004）；2浙江省人民医院浙江省胃肠病学重点实验室（杭州 310013）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）和糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）两个主要微血管并发症，其带来的视力丧失及肾功能衰竭成为严重的公共健康问题。DR、DN的确切发病机制尚未明确，DR患者中，较多同时或先后发生DN，也有部分仅有DR而未发生DN，说明单纯DR与DR伴DN患者之间存在不同的致病机制。血浆中具有大量生理功能且丰富多变的蛋白质，其组成和含量的变化成为相关疾病的重要标志［1］。目前针对单纯DR与DR伴DN患者之间血浆蛋白质组学差异尚未见报道。本研究应用label-free蛋白质组定量技术，寻找单纯DR与DR伴DN患者间差异表达蛋白，为进一步筛选二者间不同的血浆标志物提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2012年2月至2012年10月就诊于我院的16例T2DM患者，8例DR伴DN患者纳入DNDR组，8例单纯DR患者纳入DR组。DR组男4例，女4例，年龄33岁～69岁，平均（43.32±6.14）岁，糖化血红蛋白6.10%～7.50%，平均（6.74±0.45）%，DNDR组男5例，女3例，年龄35岁～67岁，平均（44.57±6.35）岁，糖化血红蛋白6.30%～7.40%，平均（6.89±0.51）%，两组患者性别、年龄、糖化血红蛋白差异均无统计学意义（P＞0.05）。所有患者均符合1999年WHO糖尿病诊断标准。纳入标准：（1）依据2002年DR国际分期标准：双眼眼底彩色照相检查符合中度以上非增殖性DR或增殖性DR。（2）依据2012年ADA筛查和诊断标准：测定即时尿标本的白蛋白/肌酐（urinary albumin/creatinine ratio，ACR）≥ 30 μg/mg，3 个月内 3 次ACR至少有2次升高。符合以上2条标准纳入DNDR组；仅符合（1），且ACR＜30μg/mg纳入DR组。排除标准：（1）冠心病、高血压病、恶性肿瘤等慢性疾病患者；（2）T1DM、妊娠糖尿病和特殊类型糖尿病；（3）严重眼部疾患影响眼底检查者；（4）青光眼、葡萄膜炎及其他视网膜疾病者；（5）剧烈运动、发热、尿路感染、肾病综合征等其他原因导致ACR升高。入组患者均知晓研究方案并签署知情同意书且经903医院伦理委员会审查批准。

1.2方法委托华大基因公司对16例血浆标本进行质检和蛋白组学质谱检测，检测的肽段、谱图数目、总蛋白均合格。

1.2.1主要试剂和仪器金标胰蛋白酶（trypsin gold Promega）购自北京华利世科技有限公司；质谱仪（Triple TOF 5600）来自AB CSIEX（美国）。酶联免疫吸附 Human PDI ELISA Kit（ab229894）购自abcam公司（美国）；CPS1 ELISA Kit（ABIN813029）购自北京4A生物技术有限公司。

1.2.2检测流程取100 μg的血浆，按蛋白质提取标准流程操作，用考马斯亮蓝法定量，12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。取100 μL蛋白，按蛋白∶酶=20∶1的比例加入胰蛋白酶，设定37℃酶解4 h，再加胰蛋白酶1次，37℃酶解8 h后对样品进行液相分离。每个组分用除盐柱除盐后冷冻抽干，再分别复溶、离心后取上清5 μL，通过色谱仪进行分离。扫描的粒子信号分别记录后合并转化成数据。

1.3生物学信息分析用Swissprot人的蛋白质数据库进行检索，同时搜索人数据库IPI_human_3.87.fasta，两者数据库相匹配。取两组样品丰度值的均数（mean）和中位数（median），计算相应的Ratio值。设定mean和median差异倍数（上/下调）均≥2.5倍为差异表达蛋白。GO注释分别描述分子功能、细胞组分和生物过程。以KEGG Pathway为单位，经显著性富集分析确定差异蛋白参与的生化代谢和信号转导通路。行蛋白互作网络分析。利用Human IGFBP7 ELISA Kit和CPS1 ELISA Kit检测两组血浆差异蛋白的表达。

2 结果

2.1DR与DNDR组间差异表达蛋白以均数和中位数差异倍数（DR vs DNDR）上/下调均≥2.5倍为标准，筛选出差异蛋白17个，上调11个，下调6个。见表1。

2.2GO注释和富集分析差异表达蛋白涉及22种细胞过程，细胞过程（cellular process）和单一生物过程（single-organism process）占比最高；涉及14种细胞组分，细胞（cell）和细胞部分（cell part）占比最高；涉及5种细胞功能，结合蛋白（binding）占比最高。见图1。

图1 基因本体分析Fig.1 The gene ontology（GO）analysis

2.3Pathway富集分析下调最明显的PAPLN蛋白和上调最明显的胰岛素样生长因子结合蛋白7（Insulin-like growth factor-binding protein 7，IGFBP7）蛋白均未富集到相关代谢通路。富集到最显著的代谢通路为丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，氨基甲酰磷酸合成酶1（Carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS1）参与其中。见图2。

表1 DR与DNDR组间差异表达蛋白Tab.1 The differential proteomics of DR vs DNDR

2.4蛋白相互作用网络分析HSPG2、CPS1、IGFBP7、TLN1、KRT5之间有相互作用（图3）。

2.5血浆中IGFBP7及CPS1蛋白水平比较ELISA法检测结果IGFBP7在DR组较DNDR组表达升高，CPS1在DR组较DNDR组表达降低，两者差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 血浆中IGFBP7及CPS1蛋白水平比较Tab.2 Comparison of IGFBP7and CPS1 protein level in blood plasma ±s

表2 血浆中IGFBP7及CPS1蛋白水平比较Tab.2 Comparison of IGFBP7and CPS1 protein level in blood plasma ±s

注：与DNDR组比较，*均P＜0.05

组别DR组DNDR组IGFBP7（pg/mL）598.46±5.96*64.76±3.28 PS1（pg/mL）147.25±6.26*538.31±5.78

3 讨论

由于生活方式、医疗保健、诊断水平等的差异，不同的研究DM患者中DR患病率有一定差异，GIUFFRE等［2］调查40岁以上DM人群DR患病率为34.1%，其中增殖性DR患病率为4.5%。DN患病率与DR程度有关，研究［3］发现87%的增殖性DR患者伴有DN。但也有部分患者仅合并DR，而不发生DN，说明两者之间的异质性决定了临床表现的不一致性。本研究共筛选出17个差异蛋白，以均数和中位数差异倍数作为筛选条件，避免了因样本量少所致的数据偏倚，同时为了避免剔除有意义的蛋白，选择差异倍数上下调2.5倍［4］。通过蛋白相互作用网络分析发现多种差异蛋白有相互作用，说明两组患者有不同的蛋白作用网络，以下重点讨论本研究发现的需要进一步验证的差异蛋白。

本研究中下调最明显的蛋白为PAPLN，但未发现有参与代谢通路。目前对PAPLN的研究较少，主要研究见于昆虫类，发现与几种细胞外基质成分和ADAMTS酶相互作用，对胚胎发育至关重要［5］。研究［6］发现，PAPLN水平对妇女盆腔器官脱垂发展有影响。本研究中该蛋白在DR组显著低于DNDR组，其相互关系需进一步研究。上调最明显的IGFBP7是一种分泌蛋白，尿IGFBP7是早期诊断肾损伤的生物标志物［7］。高血清IGFBP7水平增加了代谢综合征和胰岛素抵抗的风险，且与腰臀比、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇等代谢相关参数显着相关［8］。CAI等［9］发现，IGFBP7可抑制高糖介导的足细胞凋亡和上皮间充质转化，表明IGFBP7可能对肾脏具有保护作用。目前较多的研究IGFBP7可能与肿瘤相关，包括胆管癌［10］、滑膜肉瘤和脂肪肉瘤［11］等。由此可见IGFBP7为多功能蛋白，本研究中DR组IGFBP7显著上调，其机制是否与其肾脏保护作用有关需进一步研究。

HSPG2也称为Perlecan，是一种大型单体硫酸乙酰肝素蛋白多糖，是皮质骨腔隙小管系统的关键组成部分。在骨细胞细胞体周围的细胞周围空间内，基底膜蛋白可以降低流体流动阻力，将外部刺激传递给骨细胞胞膜［12］。研究发现Perlecan在脂蛋白代谢中起重要作用，HSPG2-rs3767140可能与降低的低密度脂蛋白c以及DM患者的高密度脂蛋白c增加有关［13］。另外，HSPG2被鉴定为系统性硬化症中内皮细胞损伤的标志物［14］。本研究发现HSPG2蛋白在DR组上调，GO分析示HSPG2为结合功能蛋白，并参与ECM受体相互作用的pathway，相关机制需进一步研究。

图2 丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路富集分析图Fig.2 Map of pathway enrichment analysis of alanine,aspartate and glutamate metabolism

图3 蛋白相互作用网络分析图Fig.3 Analysis chart of protein interaction networks

CPS1是尿素循环酶，其由碳酸氢盐，氨和ATP形成氨基甲酰磷酸酯。CPS1缺失会降低嘧啶与嘌呤的比例，影响S期进展并诱导DNA聚合酶停滞和DNA损伤［15］。ELIKTAS 等［16］发现CPS1敲低减少细胞生长，降低与核酸生物合成途径相关的代谢物水平。研究［17］发现甘氨酸和CPS1有相互关联，甘氨酸与代谢健康和胰岛素敏感性相关联，因此CPS1和相关途径在减肥维持中的可能作用。本研究中CPS1在DR组中明显下调，pathway富集分析显示为最显著的代谢通路，参与丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，其在DR伴DN中的作用机制仍待研究。

综上所述，本研究基于Label-free定量技术，并结合生物信息学，筛选出PAPLN、IGFBP7、CPS1等差异蛋白，两组患者呈现出不同的差异蛋白表达趋势。上述蛋白具有多种功能，且构成相互作用网络，为筛选血浆标志物和新的干预靶点提供依据。ELISA法对IGFBP7、CPS1进行验证，结果显示与质谱分析结果一致，提示采用Label-free定量技术是有效和可行的，但本研究样本量较少，且未进行全部差异蛋白的验证，下一步工作需要扩大样本人群，对重点研究的差异蛋白进行验证。