长链非编码RNA LINC00475影响子宫内膜癌发生发展的关联研究

陈永秀 谭晓嫦 黄晓文 麦碧 胡桂英 罗喜平

广东省妇幼保健院妇科（广州511400）

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是由于子宫内膜上皮恶变而产生的常见妇科肿瘤，在女性生殖道恶性肿瘤中所占比例高达20%～30%［1］。数据显示，2015年我国EC新发病率约为6.3万例，其发病率呈逐年上升趋势，且发病年龄年轻化［2-3］。目前对EC变早期诊断和预后判断尚未有较可靠的手段和方法。恶性肿瘤是环境-基因共同作用的结果。近年来随着生物技术的发展和应用，从分子微观角度揭示肿瘤的发生、发展过程促进了恶性肿瘤的临床诊治水平［4］。随着基因组学测序技术和生物信息学的发展，发现了人体内存在大量的非编码蛋白的转录产物，其中长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是重要的组成部分。它是一类长度超过200nt的转录单元，在许多重要的生物进程中起着至关重要的调控作用［5-6］。因此，LncRNA的异常表达可引起机体内细胞功能的异常而导致疾病发生［7］。研究报道LncRNA与癌症形成、发展、侵袭转移等过程密切相关，为恶性肿瘤的临床诊治和预后评估提供了新的生物标志［8］。目前国内外关于LncRNAs与EC关系的报道不多［9-10］，且很多研究是基于生物信息学探索LncRNAs影响EC发生、发展过程的关联；大部分LncRNAs在EC中的功能机制尚未明确［11］。此外，如何高效可靠地筛选出与EC相关的LncRNA是一个很具挑战的难题。在本研究中，笔者前期通过高通量测序技术检测EC组织的LncRNA表达，并结合TCGA公共数据库的EC表达谱数据，筛选出差异性表达的LncRNAs。同时，通过生物信息学分析鉴定在EC发病中具有潜在功能的特异性分子。基于上述研究策略，笔者筛选并初步发现，LINC00475在癌组织中呈显著的低表达状态。因此，笔者拟进一步扩大临床样本检测LINC00475在EC组织的表达情况，分析其表达与EC发病、临床进展和预后的关系，并利用功能学实验分析该LncRNA的生物学功能，阐明该LncRNA潜在的临床应用意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象资料及随访本研究的110例EC病例选取于2012年1月至2017年12月在我院行手术治疗并经病理学确诊的患者。组织标本在手术切除采集后立即置于液氮中冻存。全部患者手术前均未接受过化疗、分子靶向或激素治疗。110例患者的年龄29～77岁，平均（55.3±10.3）岁。根据2014年国际妇产科联盟分期（FIGO 2014）Ⅰ期和Ⅱ期患者共88例，Ⅲ期和Ⅳ期患者22例。组织病理类型为子宫内膜样腺癌93例、非子宫内膜样腺癌17例。根据病理分级G1级EC 35例，G2级55例，G3级20例。淋巴结转移阳性患者16例，淋巴结转移阴性患者94例。对本研究病例随访采用电话访问方式，直接联系患者本人或其家属，从病例确诊收集后每间隔6个月随访一次。随访截止日期为2018年6月30日。记录患者的生存状况。生存时间为自患者确诊之日至随访截止日期或死亡的时间，以月为单位计算。观察终点为患者死亡或随访日期截止。在随访期间失访将不纳入后续的生存分析。截止到最后一次随访时间，具有完整生存信息并纳入预后分析的病例共87例。参与本实验患者均签署知情同意书，并已通过医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂和仪器细胞培养基1640和胎牛血清购自美国Hyclone公司，转染试剂LipofectamineTM3000 Reagent购自美国Invitrogen公司。CCK8试剂盒购自上海碧云天公司，RNA提取试剂Trizol Reagents、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒（Takara）均购自大连宝生物公司。Transwell小室和基质胶购自美国BD公司，PCR引物由上海生工公司合成。酶标仪购自美国热电公司，实时荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。倒置显微镜来自日本Olympus。

1.3主要实验方法

1.3.1LINC00475载体构建参考UCSC基因组数据库LINC00475转录本序列，使用primer premier 5.0软件设计扩增基因全长的引物，采用in-Fusion技术克隆入pcDNA3.1表达载体，表达载体的酶切位点设为XhoI/BamHI；T4 DNA连接酶连接，筛选，质粒扩增并测序鉴定。

1.3.2细胞转染和筛选取对数生长期的Ishikawa细胞接种在12孔细胞板内，待细胞达到约80%汇合度，用LipofectamineTM3000转染试剂按说明书配置转染体系，将pcDNA3.1-LINC00475和pcDNA3.1空白质粒分别转染至Ishikawa细胞，转染6 h后换液培养，G418药物筛选稳定表达细胞系。细胞表达效率利用实时定量荧光PCR法（qPCR）法检测验证。

1.3.3qPCR检测基因表达用Trizol法常规提取EC组织总RNA，依照逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA后保存在4℃冰箱备用。根据LINC00475基因序列，利用Primer Premier 5.0设计特异性扩增引物，具体引物信息如下：LINC00475上游引物：CTCATCCATGCCTCCACATT，下游引物：GAGATGCCCAAAAAGCCAAG；β-actin内参引物分别是GGCGGCACCACCATGTACCCT和AGGGGCCGGAC TCGTCATACT。qPCR反应体系为 25 μL：上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 2 μL，ddH2O 10 μL，SYBR Green Mix 12 μL。扩增条件：预变性 95℃5 min，1个循环；PCR扩增95 ℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环；溶解曲线：95℃ 5 s；60℃ 1 min。降温：50 ℃ 30 s，1个循环。

1.3.4细胞表型实验细胞增殖活性检测时消化对数生长期的稳定转染细胞，以500 cells/孔分别种植于96孔细胞板中。在培养箱孵育24、48、72和96 h后，弃去培养基，用PBS清洗1～2遍，将CCK-8试剂与培养基按体积比为1∶9配制混合液，加入100 μL新配制混合培养基，置于培养箱避光继续培养2 h，用全自动酶标仪（检测波长为450 nm）检测样品吸光度值，每组细胞设置5个复孔。迁移实验所用小室为Corning公司孔径为8 μm的迁移小室，侵袭实验选用Corning公司的BD BioCoat Matrigel Invasion 8 μm小室。取200 μL细胞悬液（1×105/mL）于Transwell小室常规培养24～48 h，取出小室PBS清洗，甲醛固定，0.1%结晶紫染液染色30 min，用棉签拭去小室内层膜上的未穿透的细胞，自来水冲洗后置室温干燥。于100×显微镜下随机选取十个视野，记录迁移至微孔膜下层的细胞数量。检测细胞侵袭能力除使用专用于侵袭的小室不同外，其余操作同迁移实验。

1.4统计学方法应用R 3.2统计软件进行本研究所有数据的处理和分析。计量资料用均数±标准差描述，基因表达在癌-癌旁组间比较采用配对t检验；采用卡方检验进行计数资料及率的比较。Logistic回归模型分析基因的表达水平与EC患者临床病理特征的关系；采用Spearman进行相关性分析。Kaplan-Meier法绘制生存曲线并以log-rank检验不同组间的生存时间差异。Cox比例风险回归模型分析LINC00475表达对EC预后的影响，利用rms包建立列线图预测模型，采用Bootstrap进行内部验证，重复抽样1 000次，计算C指数（C-index）。所有检验均为双侧检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00475在EC组织中的表达如图1所示，LINC00475在EC组织中的表达水平明显低于对应的癌旁正常组织，差异具有统计学意义（0.001 2±0.000 6 vs.0.001 8±0.000 9，P＜0.001）。

图1 LINC00475在EC的表达情况Fig.1 The relative expression of LINC00475 in EC

2.2 LINC00475表达水平与EC临床特征的关联分析进一步探讨该LncRNA表达水平与EC病例的临床病理特征之间的关系。结果见表1，LINC00475表达与年龄、病理类型、FIGO分期、肿瘤分级之间无明显统计学关联（P＞0.05），但与EC淋巴结转移显著相关（P=0.030）；以无转移的EC病例作为参照，高表达LINC00475的患者淋巴结转移的风险明显下降（OR=0.28，95%CI：0.09～ 0.94）。

2.3 LINC00475表达对EC预后的影响笔者通过将EC患者LINC00475表达量和患者的生存资料进行分析，发现LINC00475高表达患者的中位生存期（median survival time，MST）为 39.6个月，较低表达组的患者中位生存期（27.2个月）明显延长，差异具有统计学意义（P=0.004，图2A）。单因素Cox回归分析结果显示：与低表达组相比，高表达LINC00475病例的死亡风险显著下降（HR=0.54，95%CI：0.11～0.92）；多因素校正后（校正年龄、FIGO分期、肿瘤分级、淋巴结转移等），LINC00475高表达后降低EC患者死亡风险的效应仍具有统计学意义（HR=0.48，95%CI：0.12～ 0.98）。纳入FIGO分期、淋巴结转移和LINC00475表达等变量建立预测EC患者死亡风险的列线图模型（图2B），该模型生存预测的C-index为0.904；应用Bootstrap法进行重抽样验证，其模型的C-index为0.839。

2.4LINC00475表达对EC细胞表型的影响见图3。CCK-8细胞增殖实验显示LINC00475过表达组细胞的增殖速率明显低于空白对照组。两组细胞在第4天时的增殖速率为：LINC00475过表达组（73.8±12.1）%，空白对照组细胞（116.5±13.4）%，差异具有统计学意义（P＜0.001）。此外，在Transwell迁移和侵袭实验中，过表达LINC00475的内膜癌细胞穿透小室的细胞数量均显著少于空白对照组细胞［迁移实验：（38.6±8.3）vs.（62.3±10.9），P ＜ 0.001；侵袭实验：（30.2 ± 12.6）vs.（48.9± 11.2），P ＜ 0.001］。

表1 LINC00475表达与EC临床病理特征的关系Tab.1 Associations between LINC00475 expression and EC clinicopathological features 例（%）

图2 LINC00475不同表达情况下EC患者的生存曲线及列线图Fig.2 Survival curve and nomogram of EC patients with different LINC00475 expression

3 讨论

在本研究中，笔者分析了LINC00475与EC发生、发展的关系。结果发现LINC00475在EC组织中低表达，其异常低表达能显著增加EC患者淋巴结转移的风险，导致患者生存时间缩短和不良预后。生物学实验证实该LncRNA能够影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移表型。

EC是女性生殖系统最为常见的三大恶性肿瘤类型之一，近年来发病率在世界范围内的上升趋势明显，严重危害妇女健康［12］。EC早期诊断的患者一般预后较好，5年生存率超过90%［2］。但是临床上仍有部分患者出现癌灶转移，导致预后不良［1］。因此，阐明EC发病的生物机制，寻找新的诊断和特异性治疗靶点对于改善EC的预后具有至关重要的作用。近年来大量研究表明，作为基因调控网络中的重要分子，LncRNA为研究复杂疾病的病理生理过程和发病机制提供了新的途径［13-15］。LncRNA以RNA的形式在多种层面上，如表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等调控基因的表达水平［16-17］。研究已证实，LncRNA与肿瘤的发生存在密切的关系，且参与了肿瘤的发生、转移和侵袭等过程［18-19］。LncRNA在EC的发生发展中亦扮演着重要角色。XIE等［20］研究发现LncRNA CCAT2在EC组织中高表达。该LncRNA可通过海绵吸附miR-216b调节Bcl-2、影响PTEN/PI3K/AKT和mTOR信号通路的活化，进而影响肿瘤细胞的生长及转移。尽管这些研究的结果表明，LncRNAs有可能在肿瘤形成、进展中起着关键的调控作用，对于LncRNAs在特定肿瘤中的表达调控以及它们参与肿瘤发生发展的分子机制仍需进一步阐明。

图3 LINC00475生物学功能Fig.3 The biological functions of LINC00475

在本研究中，笔者基于前期转录组数据提示，探讨新发现的LINC00475与EC发病和预后的关联。本研究结果显示该LncRNA在内膜癌癌组织的表达水平低于对应的癌旁正常组织，且其表达与淋巴结转移有关，能显著增加淋巴结转移的风险。生存分析结果显示低表达LINC00475的患者，其生存时间明显低于高表达组的EC患者。LINC00475能影响EC发病和预后的关系在基于TCGA公共数据库的生信分析中也得到了一致的结果，提示LINC00475是参与EC发生、发展过程的特异性分子。目前临床上尚缺乏对EC疾病精准评估的生物标志物。最近有研究报道了LINC00475在胃癌组织中联合其他9个LncRNA可作为胃癌发病的生物标志［21］，但未分析其预测效能。在本研究中，笔者发现该LncRNA结合FIGO分期、淋巴结转移等因素能对EC患者的预后有良好的预测效能，提示LINC00475可作为临床精准评估EC患者生存预后的特异生物标志物。对于LINC00475在EC肿瘤作用中的分子机制未见报道。笔者在本研究中利用系列功能学实验检测该LncRNA对细胞表型的效应，结果发现高表达LINC00475后能抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学过程。进一步通过生物信息学分析发现，LINC00475能特异性结合ADAM22基因，并潜在改变ADAM22的表达。已有报道ADAM22基因参与肿瘤细胞的粘附、增殖等生物学过程，且是影响肿瘤化疗结局的靶点［22］，故此，笔者推测低表达LINC00475通过异常调控ADAM22的表达而导致EC患者的预后不良。但是该LncRNA是在转录前还是转录后水平对ADAM22基因进行调控，具体的调控方式如何；该LncRNA如何通过调控相关基因的表达而影响EC的发生、发展，在后续研究中仍需应用系列生物学实验进一步进行验证。以往的大部分研究都是基于候选基因策略研究特定分子与疾病的关系。在本研究中，笔者利用高通量数据筛选在EC中特异性表达LncRNA，大大提高了研究的效率；此外，笔者的研究结果提示LINC00475对EC发病和预后具有良好的预测效果，亦为临床工作中对EC患者的精确诊治及预后评估提供了潜在的生物标志。

综上所述，本研究报道LINC00475是一个新的在EC中具有抑癌效应的非编码RNA，与EC发生、临床转移和预后密切相关，可作为EC发生发展过程评估的生物标志物。