NCAPH、AXL和YAP在喉癌中的表达及与预后的关系

黄永阳 张超 周延辉

河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院耳鼻喉科（河南洛阳471000）

非染色体结构维持蛋白凝缩蛋白复合体Ⅰ亚单位 H（Non-SMC condensinⅠcomplex subunit H，NCAPH）是多蛋白组成的蛋白复合体，属于Barr家族成员，在有丝分裂和减数分裂过程中对染色体的组装和染色体的分离发挥重要作用，参与调节染色体的分离及拓扑异构酶Ⅱ的活性［1］。AXL属于受体酪氨酸激酶家族，参与细胞黏附、促增殖、抗凋亡及细胞转化等各种生命活动的调节过程［2］。Yes结合蛋白（YAP）是Hippo信号通路的转录共激活因子，在器官生长、组织再生、细胞增殖等中具有关键调控作用［3-4］。研究［5-7］显示，NCAPH、AXL和YAP与多种肿瘤的发生、发展以及患者的临床预后密切相关。

目前，国内外关于NCAPH、AXL和YAP在喉癌组织中的表达及与喉癌预后关系的相关研究尚未见报道。本研究着眼于初步了解NCAPH、AXL和YAP在喉癌组织中的表达，探讨NCAPH、AXL和YAP的表达与喉癌发生、发展及浸润转移的关系，研究联合检测NCAPH、AXL和YAP在预测患者术后复发、评估远期生存中的指导意义，以期明确联合检测NCAPH、AXL和YAP可以作为一组新的喉癌预后判断、复发监测的客观指标。

1 资料及方法

1.1一般资料收集河南科技大学第一附属医院景华院区2012年10月至2013年6月喉癌患者术后组织蜡块标本40例作为实验组，同时期声带息肉患者术后组织蜡块标本40例作为对照组。纳入标准：（1）术前活检及术后病理均提示喉鳞状细胞癌；（2）均为首发病例，术前均未行任何喉癌相关治疗；（3）未患有其他恶性肿瘤和影响本研究结果的其他疾病；（4）所有喉癌患者术后均依照当时最新美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）标准给予正规的化疗、放疗；（5）临床病例资料及术后随访资料完整可靠。本研究中所有纳入对象都是男性，在收集病例标本时有2名女性罹患喉癌，但因不符合本实验纳入标准而被排除在外。所收集喉癌患者年龄32～87岁，平均59.78岁，中位年龄58.5岁。40例喉癌按照美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7版TNM分期为Ⅰ期18例，Ⅱ期11例，Ⅲ期8例，Ⅳ期3例。其中有淋巴结转移11例，无淋巴结转移29例；高分化25例，中分化11例，低分化4例；声门上型10例，声门型26例，声门下型4例。

1.2主要试剂即用型SABC试剂盒和DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物，NCAPH多克隆抗体（克隆号Ag2076，1∶100稀释）、YAP多克隆抗体（克隆号Ag4510，1∶100稀释）均购于武汉三鹰生物有限公司，AXL多克隆抗体（克隆号558，1∶100稀释）购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.3免疫组化步骤石蜡切片烤片、脱蜡、水化，自来水冲洗、蒸馏水浸泡，柠檬酸盐高压修复，PBS冲洗，3%H2O2室温孵育阻断过氧化物酶，滴加5%BSA室温孵育进行封闭，滴加一抗4℃过夜，室温放置30 min PBS冲洗，滴加二抗孵育，滴加SABC孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，显微镜下观察。

1.4结果判定喉癌组织中NCAPH阳性表现为肿瘤细胞胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒，AXL阳性表现为肿瘤细胞胞浆和胞膜出现棕黄色或棕褐色颗粒，YAP阳性表现为细胞浆和细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒。100×光镜下挑选肿瘤实质区域，200×光镜下随机挑选5个视野。根据染色强度评分：阴性=0，弱阳性=1，中等阳性=2，强阳性=3。阳性染色细胞数分级为：≤10%（阴性 =0），11% ～30%（弱阳性 =1），31% ～50%（中等阳性=2），＞50%（强阳性 =3）。当两者得分之和≥3时判定为高表达，得分＜3时判定为低表达［8］。

1.5统计学方法运用SPSS 21.0统计学软件分析，蛋白表达和喉癌临床病理特征的关系采用χ2检验、Fisher′s精确检验，相关性分析采用Spearman法，采用Kaplan-Meier法进行生存分析，绘制生存曲线，并用Log rank test方法进行统计学检验，统计结果P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1NCAPH、AXL和YAP在喉癌和声带息肉组织中的表达本研究中NCAPH、AXL和YAP在喉癌组织中的高表达率明显高于声带息肉组织（图1～3），差异有统计学意义（P ＜0.05），见表1。

2.2喉癌组织中AXL、YAP和NCAPH在不同临床病理参数中的表达本研究40例喉癌组织中AXL、YAP和NCAPH的表达与临床病理参数中的临床分期、淋巴结转移、组织分化程度有关（P＜0.05），在年龄、解剖分区的差异无统计学意义（P ＞0.05），见表2。

2.3AXL、YAP和NCAPH蛋白在喉癌组织中表达的相关性分析本研究40例喉癌组织中，AXL与YAP在喉癌中两者共高表达者18例，共低表达者10例，卡方检验分析，χ2=5.736，P=0.017（P ＜0.05），说明喉癌组织中AXL与YAP的表达差异有统计学意义，用spearman法行相关性分析，相关系数r=0.379，P=0.016（P＜ 0.05），提示两者在喉癌中的表达有相关性，呈正相关。

图1 NCAPH在喉癌组织及声带息肉组织中的表达（SP，200×）Fig.1 Expression of NCAPH in laryngeal carcinoma tissues and vocal cord polyps（SP，200 ×）

图2 AXL在喉癌组织及声带息肉组织中的表达（SP，200×）Fig.2 Expression of AXL in laryngeal carcinoma tissues and vocal cord polyps（SP，200 ×）

图3 YAP在喉癌组织及声带息肉组织中的表达（SP，200×）Fig.3 Expression of YAP in laryngeal carcinoma tissues and vocal cord polyps（SP，200 ×）

表1 NCAPH、AXL和YAP在喉癌及声带息肉组织中的表达之间的关系Tab.1 Relationship between expression of NCAPH，AXL and YAP in laryngeal carcinoma and vocal cord polyps 例

表2 喉癌组织中AXL、YAP、NCAPH蛋白表达与临床因素之间的关系（Fisher's精确检验）Tab.2 Relationship between AXL，YAP and NCAPH protein expression and clinical factors in laryngeal carcinoma tissues（Fisher′s exact test） 例

本研究40例喉癌组织中，AXL与NCAPH在喉癌中两者共高表达者12例，共低表达者12例，卡方检验分析，χ2=2.072，P=0.151（P＞ 0.05），说明喉癌组织中AXL与NCAPH的表达差异无统计学意义，用spearman法行相关性分析，相关系数r=0.228，P=0.158（P＞ 0.05），提示两者在喉癌中的表达相关性无统计学意义。

本研究40例喉癌组织中，YAP与NCAPH在喉癌中两者共高表达者12例，共低表达者10例，卡方检验分析，χ2=0.825，P=0.364（P＞ 0.05），说明喉癌组织中YAP与NCAPH的表达差异无统计学意义，用spearman法行相关性分析，相关系数r=0.144，P=0.377（P＞ 0.05），提示两者在喉癌中的表达相关性无统计学意义。

2.4 AXL、YAP和NCAPH在喉癌组织中的表达与预后的关系本研究40例喉癌患者，5年随访仍存活31例，死亡7例，失访2例，5年生存率77.5%。本研究将总生存时间作为患者预后状况的评估指标。总生存时间事件包括所有原因所导致的患者死亡，但本研究中所纳入病例患者均因喉癌及其并发症导致死亡，未出现患者因其他原因死亡的情况。

23例AXL高表达的喉癌患者中，存活15例、死亡6例、失访2例，17例AXL低表达的喉癌患者中存活16例，死亡1例，用Kaplan-Meier法进行生存分析，χ2=2.782，Plog-rank=0.095（P＞ 0.05），提示AXL的高表达与喉癌患者的生存状况的差异无统计学意义。

25例YAP高表达的喉癌患者中，存活17例、死亡7例、失访1例，15例YAP低表达的喉癌患者中存活14例，失访1例，用Kaplan-Meier法进行生存分析，χ2=4.806，Plog-rank=0.028（P＜ 0.05），提示YAP的高表达与喉癌患者的生存状况的差异有统计学意义，说明YAP的表达与喉癌患者的预后有相关性。

17例NCAPH高表达的喉癌患者中，存活9例、死亡6例、失访2例，23例NCAPH低表达的喉癌患者中存活22例，死亡1例，用Kaplan-Meier法进行生存分析，χ2=6.761，Plog-rank=0.009（P＜ 0.05），提示NCAPH的高表达与喉癌患者的生存状况的差异有统计学意义，说明NCAPH的表达与喉癌患者的预后有相关性。

2.540例喉癌患者预后因素的COX模型分析调用COX回归过程，拟合COX比例风险模型，分别分析NCAPH、AXL、YAP的表达情况对40例喉癌患者生存期的影响。筛选后的模型，只有NCAPH一个协变量，提示NCAPH的表达对患者的生存期有影响（χ2=8.680，P=0.002＜0.05）。拟合COX比例风险模型P=0.018＜0.05，说明NCAPH在喉癌中的表达强度为影响喉癌患者预后的独立因素，相对危险度HR=0.078，说明NCAPH高表达的患者死亡风险为NCAPH低表达患者的0.078倍，HR的可信区间（95%CI）为0.009～0.651。

3 讨论

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一，约占每年新发肿瘤的2.4%，常见的病理类型为鳞状细胞癌，约占95%以上［9］。尽管治疗方法不断改进，喉癌的发病率仍有增多趋势，复发亦较常见，严重危害人类健康。目前还没有特异性的指标用于喉鳞状细胞癌的诊断和预后监测。在分子水平上对喉癌的发生、发展机制及预后关系的研究，有助于喉癌诊治水平的提高，加强患者预后的评估，提高患者的术后生存质量，已成为近几年的研究热点。近年来，分子与基因标志物在恶性肿瘤的诊断、侵袭与预后的预测等方面的应用日益受到重视。研究发现许多分子标志物包括肿瘤相关抗原、细胞黏附与细胞外基质降解相关的分子、肿瘤血管生成相关的分子等与喉癌的发生、发展及侵袭性具有相关性，某些蛋白的表达改变可以预测喉癌的预后。

本研究显示，NCAPH、AXL和YAP在喉癌组织中的高表达率明显高于喉良性病变组织，提示NCAPH、AXL和YAP可能参与喉癌的发生发展过程。本研究显示NCAPH、AXL和YAP在喉癌组织中的表达与喉癌的临床分期、淋巴结有无转移、组织分化程度有关，与年龄、解剖分区无相关性。提示NCAPH、AXL和YAP可能参与了喉癌的侵袭、转移过程。本研究显示AXL与YAP在喉癌组织中的表达存在正相关，提示AXL与YAP在喉癌组织中的表达可能存在正性调控作用。本研究显示NCAPH和YAP在喉癌中的表达强度与喉癌的预后相关，NCAPH和YAP高表达提示较差的临床预后。这与其他实验研究结果3种目标蛋白在癌组织中的高表达率高于良性病变组织及正常组织一致［10-14］。随访研究显示，本研究40例喉癌患者，5年生存率77.5%。这与国内外关于喉癌生存率的报道基本一致［15］。

本研究显示AXL的表达与喉癌患者的预后差异无统计学意义，但仍不能否认AXL与喉癌的临床预后有关。本研究通过COX比例风险模型分析显示NCAPH在喉癌中的表达强度为影响喉癌患者预后的独立因素，相对危险度HR=0.078，提示NCAPH高表达的患者死亡风险为NCAPH低表达患者的0.078倍。HR的计算不仅考虑了终点事件的有无，还考虑了到达终点所用的时间及截尾的数据。本研究得出的HR值较小及AXL的表达与喉癌患者的预后差异无统计学意义，考虑有几方面的影响：（1）本次研究的随访时间较短，而喉癌的5年生存率较高，研究中获得的随访数据存在一定程度的误差；（2）本次实验研究样本量较少，需要更大的样本量来证实以及获取更加准确的研究数据。

NCAPH、AXL和YAP参与肿瘤发生、发展及预后的机制暂未明确。有研究显示，人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）致癌蛋白E7可以通过E2F1上调NCAPH的mRNA及蛋白水平，E2F1可作为转录因子作用于NCAPH的启动子区，从而激活NCAPH的表达［5］，而HPV感染是目前研究最为广泛的喉部鳞状细胞癌感染性因素［16-18］。研究还显示，敲低NCAPH可以明显抑制上皮向间质转化，NCAPH可能是通过上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）机制来影响癌细胞的迁移及侵袭能力［5］。在EMT过程中，肿瘤细胞获取间质特点并失去上皮特性，导致细胞的黏附能力降低，从而使细胞的侵袭转移能力增强［19-21］。有研究认为，癌细胞中过表达的AXL能够导致基质金属蛋白酶MMP-9基因的表达，造成基底膜和细胞外基质的分解，从而介导癌细胞的侵袭和转移。有研究提示AXL是EMT的下游效应器，能使细胞的侵袭转移能力增强。YAP是Hippo信号通路的转录共激活因子。Hippo信号通路调控抵抗失巢凋亡、促进细胞恶性转化、EMT等各种生化过程的分子机制是当前肿瘤生物学研究的前沿热点［22-24］。这提示3种目标蛋白在喉癌组织中的表达强度均与EMT机制有关联，NCAPH、AXL和YAP可能是通过多种途径联合作用参与肿瘤的发生、发展及预后。

综上所述，本研究通过检测喉癌组织和喉良性病变组织中AXL、YAP和NCAPH的表达情况，发现AXL、YAP和NCAPH与喉癌的发生、发展及预后有着密切的关系，提示NCAPH、AXL和YAP在评估喉癌患者远期生存中具有重要的指导意义。而3种目标蛋白在喉癌组织中的表达强度均与EMT机制有关联，3种目标蛋白在喉癌组织中的表达和分子作用机制可能都有一定的关联性。本研究样本量较少，实验方法较为单一，且随访时间短，所得结论需要进一步研究证实。经过扩大样本量、利用多种实验方法以及延长随访时间进一步研究，明确其作用机制，联合检测AXL、YAP和NCAPH有望作为一组新的喉癌预后判断的客观指标，甚至有望成为喉癌临床分子治疗的有效靶点。