致蓝狐肺炎的犬链球菌WF1株分离鉴定及药敏试验

2019-07-31靖吉强武世珍郭洪梅李舫

山东畜牧兽医 2019年7期

靖吉强武世珍郭洪梅李舫

靖吉强武世珍郭洪梅*李舫

（山东畜牧兽医职业学院山东潍坊 261061）

为了有效控制蓝狐肺炎的发生，减少蓝狐肺炎的危害，试验采取现场观察、细菌的分离培养和16S rRNA基因序列测定与比对等方法，对潍坊一蓝狐养殖场发生的蓝狐肺炎进行了病原学检查。结果表明：从蓝狐肺部分离到一株犬链球菌，命名为犬链球菌WF1株。说明蓝狐在通风不良、严重热应激，昼夜温差较大等不利因素的刺激下，抵抗力下降，感染了犬链球菌，导致严重肺炎。通过对犬链球菌WF1株药敏试验，发现该菌耐药性较强，但对美罗培南较为敏感。这对于蓝狐肺炎的防控具有一定的指导意义。

蓝狐肺炎犬链球菌分离鉴定药敏试验

蓝狐肺炎是蓝狐养殖过程中常见的疾病，主要发生于每年的8~9月份，发病率有时高达50%~ 90%，致死率有时近10%。疫情暴发后，相邻的蓝狐场往往先后发病，具有很强的传染性和破坏性，给广大蓝狐养殖企业带来严重经济损失。2018年9月，潍坊一蓝狐养殖场发生肺炎后来山东畜牧兽医职业学院动物医院就诊，现把病原分离鉴定情况汇报如下：

1 材料与方法

1.1 材料

发病蓝狐，取自潍坊某养殖场。血液琼脂培养基购自潍坊天衡医疗器械有限公司。Baird-parker培养基、亚硫酸铋琼脂培养基、营养琼脂培养基、伊红美兰培养基、孟加拉红培养基均购自北京路桥技术股份有限公司。药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蓝狐饲养场管理情况调查山东潍坊某规模化蓝狐场，饲养蓝狐4000只。蓝狐笼具在进狐前经碘制剂喷雾消毒。地面撒生石灰，并与表层土混匀，砸实。笼舍位于遮阳棚下。遮阳棚南北走向，棚檐高2m，棚顶高2.5m，通风良好，夏季防止蓝狐被烈日暴晒。蓝狐幼狐出生后，发育正常。饲喂杂鱼、鸭架、鸡架、鸡蛋、豆粕、玉米面、麸皮以及多种微量元素和维生素组成的预混剂等构成的混合日粮，所有饲料煮熟、搅碎后成糊状饲喂。幼狐断奶后20d免疫犬瘟热活疫苗(CDV-11株)，按瓶签注明头份，用注射用生理盐水稀释，每只肌肉注射1ml(含1头份)；间隔2周加强免疫一次。断奶后50d免疫狐狸脑炎活疫苗(CAV-2C株)。当非种用幼龄狐狸体重达到4~5kg左右时埋植褪黑激素。

1.2.2 蓝狐饲养场发病情况调查在正常饲养过程中蓝狐陆续发病，病狐体温升高，食欲下降，精神沉郁，呼唤不应，呼吸增数，流鼻涕。不愿运动，有的关节肿大，瘫痪，长时间卧伏。病狐发育迟缓，逐渐消瘦。病重者衰竭死亡，病程7~ 15d。发病期间投喂青霉素、林可霉素，效果不显著。发病后1个月，随着天气逐渐凉爽，疫情停止。发病期间，共死亡当年幼狐359只，死亡率为8.9 %。未埋植褪黑激素的成年种狐和幼龄种狐发病较少。

1.2.3 病理变化检查剖检濒临死亡的蓝狸5只，可见肺部肿胀，出血，胸腔积液。心、肝和肾未见明显异常。肠内容物很少，肠管未见明显出血性变化。

1.2.4 犬瘟热检查按照林特睿检TM犬瘟热抗原快速诊断试纸的说明书进行操作，取5只病狐眼、鼻、口的分泌物，溶于试剂盒的缓冲液中，然后取4滴缓冲液加入试纸卡的加样孔中，5~10 min内读取结果。

1.2.5 触片、染色、镜检常规无菌操作采集5只病狐肺脏，用灭菌镊子夹住肺脏一角，用无菌手术刀切下一块肺脏，用洁净的玻片在肺脏的新鲜切面上接触一下，玻片上留下一硬币大小的印迹。触片干燥后，将玻片通过酒精灯火焰的外焰3~4次，进行固定。然后用革兰氏染色液染色、显微镜油镜检查。

1.2.6 细菌的分离培养常规无菌操作采集5只病狐肺脏，放入灭菌的平皿。手持烙刀，先在酒精灯火焰的外焰烧热至微红，然后放在病肺表面片刻，大约0.2min。然后在病肺被烙过的地方用烙刀捅一个小口。取灭菌的接种环插入烙刀捅出的小口内，蘸取小口内的病料后分别接种Baird-parker培养基、亚硫酸铋琼脂培养基、营养琼脂培养基、伊红美兰培养基、孟加拉红培养基、血液琼脂培养基。37℃培养24h，观察结果。

1.2.7 16S rRNA基因序列测定与比对（1）分离菌基因组DNA提取：取血液琼脂培养基上生长出的具有完全溶血性的小菌落，接种另一血液琼脂培养基，获得纯培养物。将纯培养物用超纯水洗下后用于提取该细菌的总DNA。按照细菌基因组DNA提取试剂盒的介绍的操作步骤提取DNA。提取的总DNA用于分离菌的PCR检测。（2）分离菌16S rRNA基因PCR检测及测序：引物采用细菌16S rRNA基因的通用引物，27F：5'-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3'；1541R：5'-AAGGAGGT GATCCAGCCGCA-3'，设计扩增片段为1514bp。PCR反应体系为：DNA模板1µl，2×Master Mix 20µl，上、下游引物个1µl，超纯水17µl，震荡混匀后，1000转离心1min后放入PCR仪。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸5min。反应结束，温度降至4℃，直至取出。取5µL PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳。观察有无特定的DNA片段出现。若有目标片段出现，则将剩余的PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。将测得的PCR产物序列在NCBI数据库中，用BLAST程序在线进行基因序列相似性比对，搜索与PCR产物序列相同或相似的基因序列。

1.2.8 分离菌的生化试验将分离菌的纯培养物用革兰氏阳性菌鉴定卡(梅里埃VITEK 2GP 21341)进行生化特点检测。按全自动微生物鉴定及药敏分析系统(型号：VITEK 2 compact system)的操作手册进行操作。

1.2.9 分离菌的药物敏感性试验无菌操作将分离菌的纯培养物均匀涂布到鲜血琼脂培养基上，然后贴药敏片。37℃培养18~24h。观察并判定结果。

2 结果

2.1 镜检及分离培养的结果

5只病狐肺脏触片，染色后镜检，均发现革兰氏阳性的单个、成对或短链状排列的球菌。5只病狐的肺脏分别接种亚硫酸铋琼脂培养基、Baird-parker培养基、营养琼脂培养基、伊红美兰培养基、孟加拉红培养基，均未见任何细菌生长；但接种的血液琼脂培养基上均生长出大小一致的表面光滑、有β溶血的小菌落。

2.2 犬瘟热检查的结果

5只病狐犬瘟热检查结果：对照线(C)均显色，而检测线(T)均不显色。因此病狐未患犬瘟热。

2.3 16S rRNA基因序列测定与比对

通过对分离菌16S rRNA基因的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，发现成功扩增出约1500bp的条带。将分离菌的16S rRNA基因的序列在NC BI数据库中，用BLAST程序在线进行基因序列相似性比对，发现该分离菌与登录号为KP851852.1序列同源性为99%，因此确定该菌为犬链球菌(Streptococcus canis,S.canis)，命名为犬链球菌WF1。

附图分离菌16S rRNA基因的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳

2.4 分离菌的生化试验结果该株犬链球菌WF1的生化特点见表1。

2.5 药物敏感性试验头孢呋辛、林可霉素、四环素、庆大霉素、青霉素和头孢唑林不敏感，美罗培南、头孢吡肟敏感。具体见表2。

3 讨论

（1）犬链球菌(Streptococcus canis,S.canis)可感染犬、猫、牛和水貂等多种动物，导致被感染动物乳房炎、流产、阴道炎等[1]。这次从发生肺炎的蓝狐肺脏中只分离到犬链球菌WF1，没有分离到能导致蓝狐肺炎的多杀性巴氏杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌[2]、绿脓杆菌等常见病原菌，也未检测到犬瘟热病毒。说明犬链球菌是导致本次蓝狐肺炎的致病菌。（2）犬链球菌导致的蓝狐肺炎多见于埋植褪黑激素的当年幼狐，发病时间多为每年的8~9月份，这与蓝狐养殖场未控制好蓝狐养殖舍的温度有关。这时山东的天气多炎热，蓝狐体内的热量由于通风不良、周围环境温度高和缺少汗腺等原因在体内积聚，导致严重热应激，从而使蓝狐抗病力下降。这是诱发蓝狐肺炎的重要诱因。（3）发生肺炎的该蓝狐养殖场养殖条件简陋，苍蝇滋生严重，而苍蝇能传播多种疾病[3]。在蓝狐肺炎发生后，苍蝇不断地接触病狐的排泄物和分泌物，往返于病狐和健康狐之间，促进了犬链球菌的扩散蔓延，加重了疫情。因此蓝狐养殖场应经常灭蝇，并积极采取防止苍蝇滋生的措施，比如粪便每天清理，堆积发酵；食槽每天清洗，剩食及时处理；饲料加工的场所防止苍蝇进入。（4）蓝狐养殖场应注意厂址的选择。建场时应远离村庄和其他毛皮动物饲养场，以利于隔离饲养，减少蓝狐肺炎发生后的急剧蔓延。蓝狐饲养应提升养殖模式，蓝狐舍应建成保温棚舍，地面用水泥硬化，以提高消毒效果。每逢8~9月份，可使用风机湿帘等降温设施，减少热应激对蓝狐的危害。（5）如果蓝狐饲养场在蓝狐发病后频繁用药，易导致耐药菌株出现。本次分离到的犬链球菌WF1对四环素、庆大霉素和青霉素等多种抗菌药耐药，只对美罗培南等少数抗菌药敏感，是一个值得注意的信号。因此加强饲养管理，规范蓝狐养殖用药，推广药敏试验，这对减少犬链球菌的耐药性具有重要的意义。