猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的PCR 诊断

苏述色日

（四川省金阳县动物卫生监督所 四川凉山610025）

猪 瘟（Classical swine fever，CSF）和猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）的致病原分别为猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和 猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），两种疾病对养猪业都危害巨大。2018 年10 月某猪场发生了一起临床主要表现为发热、呼吸困难、全身出血及淋巴结肿大的疫病，通过临床症状初步判断为CSFV 或PRRSV 感染，为对病例进行确诊，笔者对其进行了PCR 诊断。

1 材料与方法

1.1 临床病料样品的采集与处理

无菌采集病死猪的淋巴结、肾脏、脾脏等病变组织，将其溶解于5 倍体积生理盐水中，经捣碎、碾磨、离心后，取上清液，-20℃保存备用。

1.2 引物设计与合成

参照马萍等[1]建立的CSFV 野毒株与疫苗株鉴别检测方法设计合成1 对CSFV 野毒株特异性检测引物（上游引物：5'-AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA-3'； 下 游 引 物：5'-GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT-3'），该引物可对CSFV野毒株扩增出641bp的特异性片段，而对CSFV疫苗株无扩增产物。参照曾繁文等[2]建立的PRRSV 不同毒株鉴别检测方法设计合成1对特异性检测引物（上游引物：5'-ATGAGTCTTCTACCCGAGG-3'；下游引物：5'-TCAGAGGTGACAGGATTG-3'），该引物可对PRRSV 的经典毒株、高致病性毒株、疫苗株分别扩增出1020bp、933bp、662bp 的特异性片段。

1.3 病毒基因组RNA 的提取与cDNA 的合成

利用病毒基因组RNA 提取试剂盒提取处理后的临床病料样品的基因组RNA，以RNA 为模板进行cDNA 合成。cDNA 合成的反应体系为：RNA 9μL、随机引物1μL、5×Buffer 4μL、dNTP 4μL、M-MLV 逆转录酶1μL、RNA 酶抑制剂1μL。cDNA 合成的反应程序为：42℃ 50min，72℃ 10min，4℃终止反应。

1.4 PCR 扩增

以合成的cDNA 为模板，分别按照马萍等[1]和曾繁文等[2]的PCR 扩增方法进行PCR 扩增，PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测分析。

2 结果与分析

如图1 所示，临床病料样品经CSFV 鉴别引物可扩增出641bp 左右的特异性片段，大小与马萍等[1]报道的CSFV 野毒株片段大小一致。如图2 所示，临床病料样品经PRRSV 鉴别引物可扩增出933bp 左右的特异性片段，大小与曾繁文等[2]报道的PRRSV 高致病性毒株片段大小一致。上述结果表明临床病料样品经PCR 检测为CSFV 和PRRSV 阳性，该临床病例发生了CSFV 和PRRSV 的混合感染。

图1 CSFV PCR 扩增结果

图2 PRRSV PCR 扩增结果

3 讨论

CSF 和PRRS 都是猪易感的病毒性传染病，两种疾病混合感染大大提高了检测难度，且临床中两种疾病引起的临床表现极其相似，确诊需借助实验室检测方法，PCR 检测方法具有敏感性高、特异性好等优点，是目前疾病诊断最简单、最准确可靠的检测方法，在基层动物疾病检测中得到了广泛应用。鉴于此，本研究采用PCR 方法对病例进行了确诊，为猪场后期及时采取预防和治疗措施提供了保障。对于CSFV 和PRRSV 的防控都以疫苗免疫为主，在疫苗接种时要注意免疫途径和免疫剂量，防止发生免疫失败。同时加强猪场的饲养管理，坚持自繁自养和全进全出制，保持畜舍环境清新，定期通风换气，减少各种不利应激因素影响，逐步达到防止疾病暴发和流行的目的。█