缺氧复氧致心肌AC16细胞损伤途径的研究*

戴文芝， 叶文峰， 何 原， 陈 灿， 黄石安， 雷 桅△， 郭 军

(广东医科大学 1心血管疾病研究室， 2附属医院心血管内科中心， 广东 湛江 524000； 3暨南大学附属第一医院心血管内科， 广东 广州 510632)

缺血性心脏病是心血管系统中致死率和致残率最高的疾病之一，临床使用经皮冠状动脉介入术疏通狭窄甚至闭塞的冠状动脉管腔，从而改善心肌血流灌注和阻止梗死面积扩大，是治疗缺血性心脏病的基本原则和有效方法[1]。然而心肌恢复血流过程会造成缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤，使治疗效果减弱甚至加重心肌梗死[2]，因此I/R损伤的发生机制一直是心脏保护研究领域的重点和难点。目前导致心肌I/R损伤的途径尚不清楚，一般认为可能与以下机制有关：(1)细胞自噬(autophagy)，自噬在缺血缺氧等应激状态下能维持细胞的存活，但是过分激活会损伤细胞，目前研究充分表明I/R特别是再灌注期间自噬上调会损伤心肌细胞[3-4]；(2)细胞焦亡(pyroptosis)，当心肌细胞发生I/R时，激活活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)系统和炎症反应，从而引起细胞的焦亡损伤[5]；(3)细胞凋亡(apoptosis)，在啮齿动物心肌I/R模型中，观察到细胞凋亡在再灌注后显著增加[6]。但是细胞自噬、细胞焦亡和细胞凋亡等不同途径在I/R心肌损伤过程中是否同时发生未见报道，本研究建立人心肌AC16细胞的缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)细胞模型，探讨不同复氧时间细胞自噬、细胞焦亡和细胞凋亡的作用，以期深入揭示I/R心肌损伤的发病过程和分子机制，从而为缺血性心脏病防治提供依据。

材 料 和 方 法

1 细胞及实验试剂

人心肌AC16细胞株购自ATCC。低糖DMEM培养基(HyClone)；无糖DMEM培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA和PBS(Gibco)；CCK-8试剂盒、细胞裂解液、ECL发光试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒(南京碧云天生物技术研究所)；兔抗人LC-3、caspase-1、cleaved gasdermin D、cleaved caspase-3、Bax、Bcl2和α-tubulin多克隆抗体(CST)。

2 方法

2.1细胞培养及实验分组 采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养细胞，每3 d更换1 次培养基，取3～5代生长良好的AC16细胞用于实验。将细胞随机分为5组：空白对照(normal control, N)组，未做任何处理；缺氧组(0 h组)，无糖、无血清培养基培养细胞并置于37 ℃、含1% O2的培养箱中缺氧处理24 h；3个缺氧复氧组，缺氧处理后将培养基换成含10%胎牛血清的低糖DMEM，置于37 ℃、21% O2条件下分别复氧处理2 h(2 h组)、6 h(6 h组)和12 h(12 h组)。

2.2CCK-8法检测心肌细胞活力 每组AC16细胞设置6个复孔，每孔加入含10 μL CCK-8的培养基 100 μL，并设置调零孔，置于37 ℃培养箱孵育2 h。450 nm 波长处检测细胞液的吸光度(A)值，实验重复3次。

2.3Western blot法检测相关蛋白的水平 细胞分组处理后，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度。90 ℃使蛋白变性，取相同质量蛋白上样，进行SDS-PAGE， 60 V、60 min和90 V、60 min条件下电泳，结束后用湿转法90 V、120 min将蛋白从凝胶上转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，加I 抗4 ℃摇床孵育过夜(LC-3 1∶1 000、caspase-1 1∶500、cleaved gasdermin D 1∶500、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Bcl2 1∶1 000和α-tubulin 1∶1 000)。相应的HRP标记 II抗(1∶2 000)常温孵育1 h，用TBST 洗膜5次，每次5 min,ECL 发光，显影，Tanon 5200成像系统检测目的蛋白并拍照，ImageJ软件分析目的蛋白灰度值。

3 统计学处理

应用GraphPad Prism5软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 缺氧复氧后心肌AC16细胞活力下降

与空白对照组比，缺氧组细胞活力下降(P<0.01)，复氧2 h组、复氧6 h组和复氧12 h组的细胞活力均比缺氧组进一步降低(P<0.05)，且复氧6 h组比复氧2 h组的细胞活力低，但随着复氧时间延长至12 h，其细胞活力与复氧6 h组相比差异无统计学显著性，见图1。

Figure 1.The cell vitality from each group determined by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsN group;#P<0.05，##P<0.01vs0 h group.

图1 CCK-8法测定各组细胞的活力

2 AC16细胞自噬随复氧时间延长而减弱

与空白对照组比，缺氧组、复氧2 h组、复氧6 h组和复氧12 h组的AC16细胞LC3-Ⅱ/-I比值增加，表明细胞自噬水平显著上调(P<0.01)。然而，与缺氧组AC16细胞相比，复氧6 h组和复氧12 h组细胞自噬水平则显著下降(P<0.05)，见图2。

3 缺氧复氧后心肌 AC16细胞发生焦亡

与空白对照组相比，缺氧组AC16细胞的pro-caspase-1蛋白表达量显著上调(P<0.05)，但cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D未见明显变化。当复氧6 h和12 h时，AC16细胞的焦亡相关蛋白cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D蛋白水平均显著增加(P<0.05)，从而提示缺氧复氧6 h后AC16心肌细胞焦亡被激活，见图3。

4 缺氧复氧致心肌 AC16细胞凋亡

缺氧及复氧处理2 h和6 h后，AC16细胞的凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达量和Bax/Bcl2比值与空白对照组相比差异无统计学显著性，当复氧处理12 h后，cleaved caspase-3表达量和Bax/Bcl2 比值明显上调(P<0.05)，说明此时心肌 AC16细胞启动凋亡程序，见图4。

Figure 2.The LC3-Ⅱ/-Ⅰ ratio in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different times. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

图2 缺氧复氧处理后AC16细胞LC3-Ⅱ/-I变化

Figure 3.The protien levels of pro caspase-1, cleaved caspase-1 and cleaved gasdermin D in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different tmes. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsN group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

图3 缺氧复氧处理后AC16细胞pro-caspase-1、cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D的蛋白水平比较

讨 论

缺血再灌注对心肌细胞造成严重损伤，再灌注过程中发生的细胞自噬、细胞焦亡、细胞凋亡与心肌梗死面积大小和心梗后左心重塑密切相关[7-9]，揭示细胞损伤途径在不同再灌注时间的启动时间和状态，有利于探讨更有效的心肌保护方法。

AC16细胞是来源于人胚胎的心肌细胞，不能发生搏动，但与人心肌细胞有相似的功能和特性。本研究采用心肌 AC16细胞建立缺氧复氧模型，模拟人体心肌缺血再灌注过程，并设置不同的复氧时间，来探讨不同复氧时间细胞自噬、焦亡和凋亡的激活状态。研究发现随着复氧时间延长细胞活力下降，证实复氧会对心肌细胞造成剧烈损伤。而观察不同复氧时间心肌细胞状态，发现缺氧组心肌细胞自噬水平升高，复氧时间增加时自噬水平下降，但与空白对照组相比，细胞自噬水平仍处于较高程度。因此缺氧诱导心肌细胞自噬，复氧则抑制自噬。Sandanger等[10]提出细胞焦亡在小鼠缺血再灌注后的心肌组织中被上调，然而本研究发现缺氧并不会引起细胞焦亡的发生，仅在复氧6 h后启动细胞焦亡，但细胞凋亡出现在复氧12 h，从而表明在缺氧复氧过程中心肌 AC16细胞焦亡早于凋亡，且复氧12 h后细胞开始遭受多途径的复合损伤。

Figure 4.The protein levels of cleaved caspase-3, Bax and Bcl2 in the AC16 cells after hypoxia/reoxygenation treatments for different times. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 h group.

图4 缺氧复氧处理后AC16细胞cleaved caspase-3、Bax和Bcl2蛋白水平的比较

本课题为研究缺血性心脏病发生的病理过程和细胞分子机制提供一种思路，同时也存在一定局限性。首先，人心肌 AC16细胞缺氧复氧模型无法完全还原体内心肌缺血再灌注状态，人体复杂的心血管系统会受到其他多重因素的影响；其次，当细胞发生焦亡时会释放促炎细胞因子如IL-1和IL-18等，造成细胞炎性损伤[11-12]。Taabazuing等[13]发现在单核细胞和巨噬细胞中细胞凋亡和细胞焦亡存在双向串扰，但在缺氧复氧模型中细胞凋亡与焦亡之间是否存在关联，以及细胞自噬、细胞焦亡和细胞凋亡的激活是否存在网络化协同作用还有待进一步探讨。

综上所述，心肌 AC16细胞缺氧复氧导致的细胞自噬、焦亡和凋亡并非同时激活，缺氧启动心肌细胞自噬，但是在复氧过程中细胞自噬水平逐渐下降，而焦亡和凋亡水平升高，且焦亡早于凋亡发生。因此心肌缺血性损伤的干预和保护策略也应该针对不同时期和不同损伤机制进行相应处理才能取得最佳效果。