雷帕霉素对过氧化氢诱导血管内皮细胞衰老的干预研究*

宋仕聪， 阮云军， 吴赛珠， 王玉筵

(南方医科大学南方医院老年病科， 广州 广东 510080)

根据2017年4月23日发布的《2016年度中国大陆冠心病介入治疗数据》[1]，2016年我国接受冠心病介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)例数超过66万，其中置入药物支架(drug eluting stents，DES)占99.6%，接受PCI患者平均年龄62岁。越来越多的老年人接受支架植入手术，在数量庞杂的DES中，雷帕霉素(rapamycin，Rapa)及其衍生物载药支架因出色的抗炎和抗增殖作用而广泛地应用于临床预防支架内再狭窄，是目前临床上最常应用的DES。

Rapa是一种具有三烯大环内脂结构的化合物，也是第1个已知的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)特异性抑制剂，而mTOR是参与细胞衰老、增殖和凋亡等生理活动的重要信号通路，因此Rapa可通过调控mTOR通路参与多种生理活动。研究证实，Rapa可延缓神经系统衰老相关疾病，如阿尔兹海默和帕金森等疾病的发生发展[2-3]，从而起到一定的抗衰老作用，但Rapa对血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)的影响尚未见报道，特别是面对我国数量庞大的老年冠心病PCI术后患者，这些老年患者的VECs往往伴有不同程度的衰老，明确Rapa对这些老年患者VECs衰老的影响有利于为PCI术后患者的二级预防提供参考。为此我们开展了本研究，现将相关研究结果报道如下。

材 料 和 方 法

1 主要材料及仪器

人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)由南方医科大学中心实验室提供。Rapa和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)均购自Selleck；细胞用H2O2购自上海麦克林公司；澳洲胎牛血清和无酚红DMEM高糖培养基均购自Gibco；MTT购自Sigma-Aldrich；衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-Gal)染色试剂盒购于上海碧云天公司；兔抗人β-actin、Rb、磷酸化Rb、LC3B、beclin-1和p21Ⅰ抗均购自CST。半干转印仪购自Bio-Rad；日立H-7650透射电子显微镜购自日立公司；酶标仪购自Thermo。

2 方法

2.1细胞培养 HUVECs复苏后予含10%FBS的无酚红DMEM培养液置于37.0 ℃、5%CO2孵育箱中培养；隔日换液；待细胞融合率达80%进行传代；取3～5代细胞进行实验。

2.2细胞分组和处理 将细胞随机分为：(1)空白(blank)组：予以正常培养液培养细胞；(2)衰老(H2O2)组：予以正常培养液加终浓度200 nmol/L H2O2孵育24 h；(3)Rapa+H2O2组：在衰老组处理的基础上，根据Rapa说明书先予以10 μmol/L 的Rapa预处理0.5 h；(4)3-MA+H2O2组：在衰老组处理的基础上，根据3-MA说明书先予以50 μmol/L的3-MA预处理0.5 h。

2.3MTT比色法检测细胞活力 将细胞以1.0×108/L的密度接种于96孔板，每孔100 μL，各组设5个复孔，各组处理如上述；然后弃去旧培养液，加入DMEM与MTT比例为10∶1的不含血清混合培养基，避光孵育2 h；最后弃去含MTT培养基，每个孔中依次加入150 μL DMSO，震荡5 min后酶标仪测定570 nm处吸光度(A)值。实验重复3次。

2.4细胞SA-β-Gal染色 HUVECs消化离心后以适当密度接种于6孔板，待细胞融合率达50%～60%后进行细胞分组处理；清洗细胞，每个孔各加入4%多聚甲醛1 mL，室温固定15 min；按照1∶1∶93比例加入染色液A、B和C，最后按每1 mL加入50 μL的比例加入X-Gal溶液配置成染色工作液；清洗细胞后每孔中加入1 mL染色工作液，保鲜膜封住6孔板防止蒸发，37 ℃不含CO2孵育箱过夜；最后普通光学显微镜拍照，100×视野下每组随机观察5个视野，记录各组5个视野总共蓝染细胞的个数及观察总数，以阳性个数/总细胞数代表衰老水平。

2.5透射电子显微镜观察细胞超微结构 细胞以适当密度接种于60 mm培养皿中，然后根据不同分组予相应处理；消化细胞，把细胞转移至1.5 mL EP管中，离心；沿着各个EP管壁缓慢加入1 mL预冷的5%戊二醛固定液，4 ℃固定24～48 h；环氧树脂Epon812包埋剂37 ℃浸透过夜；再将细胞包埋，60 ℃聚合48 h；在AO超薄切片机下切1 μm的半薄切片，用铜网捞片；醋酸铀染色3 min，双蒸水漂洗，铅染色3 min，双蒸水漂洗，自然风干；观察，拍照。

2.6Western blot实验 HUVECs分组处理如上述，加入RIPA冰上裂解30 min提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。在组装好的电泳玻璃板中加入10%过硫酸铵、四甲基二乙胺、30%丙烯酰胺(30%Acr-Bis)、蒸馏水等配制成适当浓度的堆积胶与分离胶，插入梳子，每孔加入20 μL总蛋白，完成后续电泳、转膜及封闭后，分别以抗Rb、p-Rb、LC3B、beclin-1、p21和β-actinⅠ抗4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min，37 ℃孵育Ⅱ抗1 h，TBST洗膜3次，ECL显影。实验重复3次。

3 统计学处理

所有数据均采用SPSS 19.0软件进行分析。所得数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示。多组之间的比较分析采用单因素方差分析法，组间多重比较采用最小显著差异(LSD)法；两样本均数的比较采用独立样本t检验；率之间的比较采用卡方检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 衰老组细胞活力降低，而Rapa可增强细胞活力

200 nmol/L的H2O2可使细胞活力降低，与空白组相比差异具有统计意义(P<0.01)，后续的衰老染色及Western blot证实细胞衰老模型构建成功，这与我们前期研究结果一致[4]。与衰老组相比，Rapa组细胞活力显著增强(P<0.05)，但予以自噬抑制剂3-MA后细胞活力显著下降(P<0.05)，见图1。

2 Rapa可延缓细胞衰老，3-MA加速细胞衰老

与空白组相比，经H2O2作用的衰老组细胞体积增大，胞质蓝染增多，SA-β-Gal染色阳性细胞显著增多(P<0.05)，p-Rb表达增多(P<0.05)，p-Rb/Rb比值增大，p21表达增多(P<0.05)。与衰老组相比，加入Rapa预处理的HUVECs衰老染色阳性细胞减少(P<0.05)，细胞体积相对正常，p-Rb表达减少(P<0.01)，p21表达减少(P<0.05)；相反地，加入自噬抑制剂3-MA组细胞衰老染色阳性细胞增多(P<0.05)，胞体皱缩、变形，胞核蓝染，同时伴有p-Rb和p21表达增多(P<0.05)，见图2。

Figure 1.MTT assays were performed to assess cell viability in each group. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsblank group；*P<0.05vsH2O2group.

图1 MTT检测各组细胞活力

Figure 2.The senescence indicators of each group. A: the results of SA-β-Gal staining, the senescent cells were stained in deep blue, while pretreatment with Rapa reduced the blue staining cells; B: the protein expression levels of p-Rb, Rb, p21 and β-actin in different groups were detected by Western blot. Mean±SD.n=5.##P<0.01vsblank group；*P<0.05vsH2O2group.

图2 各组细胞衰老指标检测

3 Rapa组细胞结构完整，并伴有自噬小体形成

空白组细胞结构正常，线粒体丰富；衰老组细胞肿胀，线粒体数量减少，线粒体嵴消失，空泡化明显，可见线粒体肿胀；Rapa组细胞结构完整，与空白组相比线粒体数量减少，但可见双层膜包绕着待降解物的结构，即自噬小体；3-MA组细胞肿胀，细胞结构紊乱，线粒体进一步减少且肿胀明显，可见胞质空泡化，未见自噬小体，见图3。

Figure 3.The subcellular structure of cells in different groups observed by TEM. Red cycles show the mitochondria; red arrows indicate the formation of autophagosomes; yellow arrows show the vacuolation of mitochondria; blue arrows show the vacuolation of cytoplasm.

图3 透射电子显微镜观察细胞超微结构

4 Rapa组自噬活性升高，3-MA抑制细胞自噬

与空白组相比，衰老组beclin-1和LC3-II表达增多(P<0.05)；与衰老组相比，Rapa组beclin-1和LC3-II表达增多更为显著(P<0.01)；与衰老组比较，3-MA组自噬活性显著降低(P<0.05)，见图4。

讨 论

Rapa分子式为C51H79NO13，是第1代DES常用的涂层药物，可通过阻断细胞周期中G1期向S期转换从而抑制血管平滑肌细胞过度增殖导致的支架内狭窄[5]。同时由于Rapa具有独特的对mTOR抑制作用，可通过抑制mTOR促进自噬泡的形成，因而Rapa是研究自噬最常用的工具药物。由于VECs与血液循环中的促动脉粥样硬化因子，如ox-LDL、高糖、活性氧和炎症因子等直接接触，因此VECs又称为抗动脉粥样硬化“第一道防线”。VECs衰老往往伴有屏障功能和内分泌功能下降，是动脉粥样硬化的独立危险因子[6]，心脑血管疾病发病率随着年龄逐渐增加的一个重要原因就是由于VECs衰老降低了这些疾病的发病阈值[7]。因此，探索VECs衰老的机制，研发抗衰老药物是防治心脑血管疾病行之有效的途径。

Figure 4.The protein expression of autophagy proteins of each group. Mean±SD.n=3.##P<0.01vsblank group；*P<0.05vsH2O2group.

图4 各组细胞自噬蛋白表达分析

本研究揭示，Rapa可促进VECs自噬，表现为自噬相关蛋白表达增多及透射电镜捕捉到的自噬小体；而Rapa在激活VECs自噬的同时可延缓衰老，表现在细胞活力的增强，细胞结构的改善及衰老相关标志物表达的减少；相反地，给予自噬抑制剂3-MA则使细胞衰老加速；因此，我们推测激活自噬是Rapa延缓VECs衰老的重要机制。

Rapa药物涂层支架置入冠脉后，以“先快后慢”的形式释放，一般在30 d左右药物释放率达80%以上，残余的Rapa以极低浓度继续作用于血管，起到抑制内皮化的作用[8]。研究证实，低浓度的Rapa可通过促进血管平滑细胞凋亡从而抑制细胞过度增殖[9-10]，但对VECs功能和结构影响如何还未见报道。本研究发现低浓度Rapa可改善活性氧诱导的VECs衰老，改善细胞结构，这与国内外其它研究相符，如李锦等[11]证实Rapa通过激活自噬延缓高糖诱导的肾系膜细胞衰老，减少肾系膜细胞SA-β-Gal染色阳性率；秦登科等[12]使用Rapa减轻成纤维细胞衰老的研究等。我们认为，Rapa除了通过抑制血管平滑肌增生起到抗增殖作用之外，还可通过延缓VECs衰老，减少VECs迁移和增殖刺激，从而避免了VECs过度增生，抑制血管内皮化，发挥抑制支架内再狭窄的作用。事实上国外学者早已通过在体实验证实血管内皮祖细胞衰老与PCI术后再狭窄发生息息相关，是再狭窄的独立危险因素[13]，其具体机制可能与衰老的内皮祖细胞一方面转化成衰老的VECs，另一方面衰老的内皮祖细胞和衰老的VECs共同分泌血管紧张素、内皮素1和生长因子等，促进血管平滑肌迁移、增殖，加速内膜增生，导致再狭窄发生[14]。

同时，我们的研究提示自噬与衰老存在联系，适当地上调自噬可延缓衰老。研究表明，在小鼠中过表达自噬相关基因ATG5可使这些小鼠寿命延长17.2%[15]；使用Rapa可明显减轻氧剥夺导致的细胞损伤[16]，这些结果都与本研究相互印证。适当地上调自噬可延缓衰老，特别是在本研究中所使用的H2O2诱导VEC衰老，活性氧可通过直接作用激活蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)，AKT通过磷酸化结节性硬化复合体2(TSC2)，导致TSC1-TSC2复合物形成障碍，激活小G蛋白RHEB，从而激活mTOR[17]，抑制自噬；各种致衰老因子如活性氧、缺氧、营养缺乏均将直接导致TSC2磷酸化增加，TSC1-TSC2复合物形成障碍，RHEB被激活，从而激活mTOR，抑制自噬，加速细胞衰老[18]。另外，细胞衰老的重要驱动因素就是胞内错误折叠蛋白、受损DNA和受损细胞器增多，细胞新陈代谢减缓，而自噬恰好可以把这些大分子物质和受损的细胞器降解成葡萄糖、氨基酸等供机体循环利用，从而起到一定延缓衰老作用[19]。值得注意的是，自噬的抗衰老作用只在细胞衰老的初期起作用，在衰老的终末阶段，过度的自噬反而会加剧自身消耗，加速细胞衰老。

另外，我们注意到与空白组相比，衰老组自噬相关蛋白表达增多，这是因为诱导衰老所使用的H2O2作为一种外源性活性氧，可导致胞内脂质过氧化，引起细胞应激反应，而自噬作为细胞在特定环境的适应性调整活动，会在应激时显著增强[20]。相反地，予以自噬抑制剂3-MA后，这种适应性调整被完全阻断，衰老加剧，细胞功能更差，细胞结构破坏明显。

综上所述，本研究观察到Rapa可延缓H2O2诱导的VECs衰老，其作用机制可能与促进自噬相关。但是，由于本研究是体外细胞实验研究，仍缺乏动物实验结果支持。而且，Rapa作为一种抗生素同时具有抗炎作用，Rapa的抗衰老作用不能简单推断由激活自噬导致的，还可能与抗炎作用相关。因此，还需要更多的研究明确Rapa延缓VECs衰老的机制，为心脑血管疾病的防治提供参考。