白酒中酚酸及酚酸酯检测方法的研究

王 戎，廖勤俭，安明哲，李杨华，周韩玲，王小琴

(宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾644007)

酚酸是一类含有酚环的有机酸，其苯环上带有多个-OH以及-COOH，表现出广泛的生理活性，如抗氧化、清除自由基、抗紫外线辐射、抑菌效应，在医药、化妆品原料和食品添加剂等方面有着广泛用途[1]。酚酸酯，是酚酸的-COOH亲水端消失，与醇的-OH端脱水酯化而成的一类化合物，极性变弱，亲酯性变强，更容易深入生物膜脂质双分子层结构中发挥抗氧化作用，在食品加工、化妆品行业具有更广泛的应用[1]。

白酒酿造的原辅材料本身存在一些酚酸类物质，酿酒过程中，原辅材料在各酶系、微生物的作用下也会生成一些酚酸及酚酸酯，这些具有生物活性的物质经长时间的酿造过程、独特的蒸馏过程进入酒体，使得白酒产品中也具有一定浓度的该类活性物质。分析白酒中所含有的酚酸及酚酸酯类活性物质，明确其种类和含量，有利于提升白酒的品质，并有助于对白酒的质量进行有效监控。

目前，文献报道对于酚酸的分析检测方法主要有薄层色谱法[2]、气相色谱-质谱联用（GC-MS）[3]、反向液相色谱法[4]、液相色谱-串联质谱法（LCMS/MS）[5-7]等。由于白酒成分极其复杂，酚酸及酚酸酯类化合物在白酒中的含量低，检测难度较大。而且，酚酸本身含有较多-OH和-COOH，使得它们具有极性强、柱保留弱的特点，而酚酸酯的极性相对较弱，柱保留较强，所以，要同时分离并检测这两类化合物的难度就更大。HLB小柱对这两类亲水疏水性质不同的化合物均具有一定的柱保留；相反，如果采用其他类型的固相萃取小柱（如C18小柱）进行预处理，样品中部分酚酸无法保留在小柱上，难以实现准确检测。由此，笔者采用固相萃取小柱（HLB小柱），结合高分辨的液相色谱-四级杆飞行时间质谱（LC-QTOF），能准确定量分析白酒中的10种酚酸及酚酸酯类化合物，同时利用酚酸及酚酸酯类化合物的质谱特征离子，可以为定性研究白酒中存在的更多改性酚酸类化合物提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

耗材及试剂：没食子酸（J&K,99%）、阿魏酸（J&K,99%）、香草酸（J&K,99%）、丁香酸（TGI,纯度≥97%）、芥子酸（J&K,98%）、咖啡酸（J&K,99%）、原儿茶酸（J&K,99%）、没食子酸乙酯（J&K,98%）、香草酸乙酯（J&K,98%）、阿魏酸乙酯（J&K,97%），甲醇（MERCK,LC-MS级），超纯水，白酒样品（实验室自备）。

仪器设备：美国Agilent公司1290系列高效液相色谱仪(HPLC)-6520B系列质谱检测器（QTOF），Agilent MassHunter数据采集工作软件、定性定量分析软件，Reeko公司高通量全自动固相萃取仪（Fotector Plus），Reeko公司全自动氮吹仪（Atuo EVA），Milli-Q超纯水机（美国Mimpore公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1×100 mm 1.8-micron)；柱温，30 ℃；流速，0.2 mL/min；进样量，2 μL；流动相为甲醇B（液质级）和超纯水A（含0.1 g/L甲酸）。梯度洗脱条件：0～15 min，5%～100%B；15.1 min～17 min，100%B；17.1～19 min，5%B；20 min，stop。

1.2.2 质谱条件

采用电喷雾电离源(DESI)，负离子模式扫描，离子源温度为325℃，干燥气流量为10 L/min，雾化器压力为40 psig，碰撞电压为110 V。

1.2.3 酚酸及酚酸酯标准溶液配制

分别准确称取10种酚酸及酚酸酯标准品各10mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的各酚酸及酚酸酯标准储备液，在-20℃保存。酚酸混合标准工作液采用梯度稀释法，现用现配。

1.2.4 样品前处理

白酒样品10 mL，于80℃蒸发浓缩至2 mL，用超纯水稀释至10 mL，上样经甲醇活化的HLB小柱，0.1 g/L甲酸水淋洗，90%甲醇水溶液洗脱，甲醇水洗脱液经氮气吹干，1 mL甲醇溶解，作为待测样品。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

由于酚酸类物质本身含有-OH、-COOH基团，使得它们具有极性强、柱保留弱的特点。方法考察了流动相水相中加甲酸与不加甲酸，以及添加甲酸量对分析结果的影响。流动水相中不添加甲酸，出峰时间靠前的几个化合物，出现峰宽，峰拖尾，且难于分离的情况，详见图1；流动相水相中甲酸含量为1.5 g/L时，目标化合物响应明显降低，特别是极性较弱的酚酸酯，如阿魏酸乙酯无响应，详见图2。经过反复考察，确定采用甲醇-水作为流动相，且水相中添加0.1 g/L甲酸为最佳，不仅可以延长酚酸类物质的柱保留，实现几种化合物的良好分离，又不至于造成质谱负模式检测条件下仪器噪音基线过高，检测灵敏度降低等问题，详见图3。各目标物的出峰时间及M/Z见表1。

2.2 前处理条件优化

图1 不添加甲酸的对照品色谱图

图2 添加1.5 g/L甲酸的对照品色谱图

图3 添加0.1 g/L甲酸的对照品色谱图

白酒产品中，强极性有机酸和糖与酚酸出峰时间比较靠近，如果将样品浓缩后直接进样检测，对样品中酚酸的检测干扰非常大，所以必须除去样品中的强极性有机酸和糖类物质。经过考察，选择HLB固相萃取小柱对白酒产品进行预处理。上样HLB小柱后，强极性酸、糖类物质经由甲酸水淋洗除去，此时所要检测的目标化合物酚酸及酚酸酯仍保留在小柱上，再经由甲醇洗脱下来，实现样品中目标化合物与杂质的分离，避免检测过程中杂质的干扰，详见图4。未经HLB处理的白酒10倍浓缩样品，2～5 min之间均被不可分离的乳酸等覆盖，严重影响目标物的检测结果，详见图5。

图4 样品HLB前处理总离子流图

图5 样品未经HLB前处理总离子流图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性方程、检测限和精密度

精密吸取1.2.3的标准储备液，用70%甲醇稀释标准储备液，分别配制成浓度为20 μg/L、80 μg/L、400 μg/L、800 μg/L、1500 μg/L、2000 μg/L 的标准溶液，并进样LC-QTOF联用仪。以标准对照品的峰面积（Y）对相应浓度（X）进行线性回归，得到回归方程和线性相关系数。各化合物信噪比S/N=10时对应的浓度为定量检测限（LOD）。结果列于表1。

2.3.2 加标回收率

白酒样品3份，各10 mL，其中的2份分别加入酚酸标准溶液 100 μg/L和800 μg/L，按照1.2.4方法处理后作为加标回收率待测样品，考察方法的加标回收率。取加标100 μg/L的加标回收率待测样品，在1 d内连续进样6次，计算10种目标化合物峰面积的RSD，考察方法的重复性、稳定性。结果表明，仪器精密度良好，详见表2。

表1 目标化合物的出峰时间、质荷比、线性方程、相关系数、检出限

表2 目标化合物的回收率和精密度

3 结论

本研究通过固相萃取小柱(HLB小柱)技术进行白酒样品前处理，能有效地除去白酒中强极性的酸类、糖类物质，实现样品中目标化合物与杂质的分离，避免检测过程中杂质的干扰。结合液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用(LC-QTOF)方法，在水相流动相中适当的添加0.1 g/L的甲酸，能有效地分离10种酚酸及酚酸酯类化合物，以目标化合物的质荷比、结合出峰时间进行定性定量分析，方法灵敏度显著提高，同时可以降低基质干扰和信噪比，测定结果更加准确可靠。本研究建立的白酒中酚酸及酚酸酯类化合物的检测方法，10种化合物的线性关系良好，相关系数（r2）均不低于0.994，回收率在88.7%～99.7%之间，RSD均小于1.3%。该方法稳定性好、灵敏度高，可以为白酒中其他生物活性成分的开发提供技术支持。

喻丽红等[8]研究阿魏酸乙酯对胃癌SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响结果表明，阿魏酸乙酯能有效抑制SGC-7901细胞增殖，并能诱导SGC-7901细胞凋亡，两种作用均呈现对浓度和时间有依赖性。王汝涛等[9]对阿魏酸乙酯的药理活性及其机制研究中发现，阿魏酸乙酯抑制由ADP诱导的血小板聚集作用比阿魏酸强；阿魏酸乙酯对CCb引起的小鼠急性肝损伤有明显的保护作用，其作用强于阿魏酸；阿魏酸乙酯具有保护血管内皮细胞，减轻过氧化氢损伤的作用。闫军等[10]通过研究咖啡酸、阿魏酸和香草酸对酪氨酸酶活性的影响，寻找酪氨酸酶抑制剂，从而为治疗色素增加性皮肤病筛选药物，试验结果表明，香草酸为良好的混合型酪氨酸酶抑制剂。从表2可看出，所检测白酒样品中香草酸和阿魏酸乙酯的含量相对较高，在80～100 μg/L之间，原儿茶酸、阿魏酸、丁香酸和香草酸乙酯的含量在10～30 μg/L之间。由此可见，所检测白酒样品中存在具有药理活性的香草酸、阿魏酸等酚酸类化合物，且这些酚酸类化合物在白酒的酸性环境下易与乙醇自然酯化而成药理活性更高的阿魏酸乙酯等酯类化合物。