高温大曲中霉菌的筛选及其挥发性产物分析

鲁 珍，王红照，李恩中，胡 莉，张建设，郜胜勤

（1.黄淮学院生物工程系，河南驻马店463000；2.河南豫坡酒业有限责任公司，河南驻马店，463900）

酱香型白酒是我国的传统香型，酱香突出，幽雅细腻，历史悠久。酱香型白酒中的酱香风味物质主要来源于高温大曲，高温大曲制曲过程中酱香风味物质的形成与微生物发酵及其所代谢的酶系、美拉德反应有着密切的联系[1]。细菌、酵母是主要的生香微生物，但霉菌也能产生一些风味物质或风味前体物质，对酱香酒酒体的风格特征具有一定贡献[2]。霉菌参与酱香型白酒的全部生产过程，如分泌高活性的糖化酶、液化酶、蛋白酶等，是白酒发酵原料中淀粉等大分子物质分解的主要动力之一[3]，并能为酵母菌的繁殖和发酵提供底物，转化为乙醇和多种呈香风味物质，提升出酒率和优级品率[4]。王晓丹等[5]从遵义地区的酱香型大曲中分离1株产多种酶并同时产多种香气成分的霉菌，是酱香大曲微生物组成中的重要霉菌之一。

由于酱香香味成分复杂，与原料的成分和菌种代谢产物有密切联系，而且酱香型酒的特征性风味化合物研究尚未取得确切结果，严重制约了形成酱香风味的各种微量成分的深入研究与应用，严重影响酱香型白酒的科学理论发展，同时也限制了其生产规模的进一步扩大[6]。本研究从本地酱香高温大曲中分离筛选出产酱香的霉菌菌株，并通过GCMS分析来确定霉菌对酱香型白酒风味的贡献，为本地白酒后期相关研究提供借鉴，以期对改善酒体质量提供实际指导。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

本研究所用高温大曲在驻马店市西平县某酒厂车间选取，大曲的采样按“四分法”进行取样，于-18℃储存备用；所用高粱和麸皮皆为酒厂提供，保存于4℃冰箱中备用。

试剂：本研究所用试剂均为分析纯及以上级别，溶液均由双蒸水配制。

分离筛选培养基：马铃薯琼脂培养基和察氏培养基[7]。

液体种子培养基：20 g蔗糖，20 g蛋白胨，10 g酵母粉，1 L蒸馏水，加热溶解，冷却后调pH值至5.0～6.0，121 ℃灭菌20 min。

液体培养：菌株经平板活化后，挑取少量菌体接种于液体培养基中，以28℃、120 r/min摇床培养2～3 d。

固体培养基：30 g高粱粉加蒸馏水15 mL，加入250 mL三角瓶中搅拌均匀，121℃灭菌20 min。

仪器设备：SHP-250FE型智能生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司；LDKM-40KCS型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；UB102i型生物显微镜，重庆奥浦光电技术有限公司；JB5374-91型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司；6890N/5975B气质联用仪，美国安捷伦公司，75 μm(Carboxen/PDMS)固相微萃取头，美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 霉菌的分离纯化培养

取已处理的大曲样进行梯度稀释（10-1～10-5），涂布在培养基上35℃培养48 h。挑取具有霉菌特征的单菌落进行纯化培养，然后接种到马铃薯斜面培养基上，保存备用。

1.2.2 霉菌的鉴定

1.2.2.1 形态学分析

在光学显微镜下观察菌丝及其孢子形态特征，结合真菌鉴定手册[8]，进行霉菌种属的初步判断。

1.2.2.2 霉菌生理生化试验[9]

霉菌碳源的利用：用不含碳源的察氏培养基，加入5%的果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖和乳糖分别培养，观察霉菌利用碳源的生长情况。

霉菌氮源的利用：用不含氮源的察氏培养基，分别加入3%的尿素、硫酸铵、牛肉粉、大豆提取物、硝酸铵分别培养，观察霉菌利用氮源的生长情况。

1.2.2.3 分子生物学鉴定

由江苏金斯瑞生物科技有限公司完成，使用BLAST方法将测序结果与GenBank数据库中已知真菌序列进行同源性分析。

1.2.3 霉菌固态发酵产物气质分析

1.2.3.1 固态发酵产物的制备

无菌条件下，吸取10 mL液体培养基的菌株种子液，加入固态发酵培养基中，用棉塞塞紧瓶口，28℃恒温发酵7 d。

1.2.3.2 固态发酵产物挥发性成分提取

顶空固相微萃取的操作步骤：将放置于冷冻室的样品先在室温下解冻，再取4 g或6 g（根据顶空瓶的容积大小提取）固态发酵后的培养基加入顶空萃取瓶中，加盖密封，在60℃恒温条件下，先平衡10 min。将预先进行高温老化（240℃，30 min）后的SPME针头插入顶空样品瓶，推出萃取纤维头，顶空萃取30 min，随后于GC-MS进样口以240℃解析5 min[10-11]。

1.2.3.3 GC-MS条件[12]

色谱条件（GC）：J＆WDB-5石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；以 He为载气，恒定流速为1.0 mL/min，不分流进样；进样口温度240℃；程序升温：初始温度40℃，保持3 min；然后以5℃/min升至120℃，保持4 min，8℃/min的速率升温到200℃，保持8min，10℃/min升至240℃，保持10min。

质谱条件（MS）：电离方式为EI，电子能量70 eV；发射电流：350 μA；接口温度250 ℃，离子源温度230℃；扫描质量范围为33～450 u。

1.2.4 霉菌酶活的测定[13]

对分离筛选得到的霉菌进行果胶酶、纤维素酶、淀粉酶、糖化酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶的测定并进行比较。

具体方法为将分离得到的霉菌在斜面养基上活化2次，再接种到斜面培养基上于30℃条件下培养7 d，在无菌条件下加入5 mL的灭菌生理盐水，用移液器反复冲洗孢子呈孢子悬浮液，取1 mL孢子悬浮液加入已灭菌的麸皮培养基中。在30℃条件下培养72 h，每隔12 h摇匀1次。培养好后，取相当于10 g的绝干培养物于100 mL水中，在40℃水浴锅中保温1 h，每隔15 min搅拌1次，过滤，滤液为粗酶液，用于酶活测定。

2 结果与分析

2.1 分离纯化及形态鉴定

利用稀释平板涂布法对高温大曲中霉菌进行分离纯化，通过肉眼观察对菌株的个体形态和菌落形态进行辨认，根据形状、菌落表面干湿状态、透明状态、光泽度、颜色、附着程度筛选出1种菌落形态不同的菌株（B），如表1和图1所示。

表1 霉菌宏观形态描述

形态学观察只能初步鉴别，需要进一步进行生理生化试验及分子生物学分析，才能鉴定其种属。

2.2 生理生化实验结果

在碳源利用试验中，B菌对麦芽糖的利用效果最好，其次是果糖和蔗糖。在氮源利用试验中，B对牛肉粉、大豆粉、硝酸铵利用效果最好，其次是亚硝酸铵，对尿素的利用效果最差，如表2和表3所示。

2.3 分子生物学鉴定结果（图2）

图1 B菌株镜检图片和菌落形态

表2 碳源利用结果

表3 氮源利用结果

为了对所筛选菌株做进一步鉴定，对系统发育树进行了分析。结果显示，菌株B与Aspergillus niger序列相似性最高，为99%，结合形态及生理生化特征，确定B菌株为黑曲霉，有学者曾对茅台酒大曲中的微生物群落进行分离鉴定，结果表明，在茅台酒生产过程中微生物群落极其复杂，包括大量霉菌，其中黑曲霉所占比例最高[14]。

2.4 固态发酵产物挥发性物质检测结果

图2 B菌株的系统发育树

霉菌在发酵过程中所生成的高级醇、醛、酮、酯等呈香物质，是形成酱香酒风味物质及风味前体物质的重要来源[5]。本研究对霉菌进行了模拟固态发酵试验，通过固相微萃取和气相色谱分析技术，对固态发酵产物的挥发性香味成分进行测定并分析。结果表明，霉菌发酵产物中共检测出43种成分，包括5种未知化合物。其中，检测出的醛类物质有4种，占香气成分的4.4%；醇类物质有5种，占香气成分的9.29%；酸类成分有2种，占香气成分的3.79%；酯类成分有4种，占香气成分的2.72%；酚类成分有3种，占香气成分的36.85%；呋喃类成分有2种，占香气成分的5.86%；另外还有其他香味成分，如3-羟基-2-丙酮、乙苯、苯乙烯、塞舌尔烯等，占香气成分的3.8%（表4）。

总的来说，酚类物质、醇类物质、呋喃类物质所占的比例最高，醛类物质、酸类物质、酯类物质和其他香气成分所占比例较少。据此，我们推断霉菌对固态发酵产物贡献香味成分最多的物质是酚类、醇类和呋喃类。酚类物质中的2-甲氧基苯酚含量高达17.21%，呈现出较浓郁的甜香和木香。另外，愈创木酚含量也较高，高达14.88%。有研究发现，这种物质具有烟熏风味，是酱香型白酒中主要的酚类风味物质，同时具有抗氧化活性[15]。莫新良等[16]发现黄酒贮存期间，香草醛是4-乙烯基愈创木酚降解的主要产物，而香草醛具有甜香味。因此，含量较高的愈创木酚对后期白酒的陈化具有重要作用。杨玉波等[17]研究还发现苯乙醛和4-乙烯基愈创木酚的香气活力值较高，是高粱蒸煮的重要香气成分。

醇类的含量也较高，醇和酸会通过酯化反应大量合成酯类，会赋予白酒更多的香味物质，适量的高级醇能够赋予白酒良好的感官特征。其中在醇类物质中仲丁醇的含量最高，呈现出类似葡萄酒的风味，其中乙醇的含量也较高，会呈现出类似玫瑰花和蜂蜜香味[18]。

呋喃类物质是白酒中一类重要的呈香物质[19]，本研究中检测到的有2,3-二氢苯并呋喃和2-戊基呋喃2种物质，其中2-戊基呋喃是主要的呈果香物质，王晓丹等[5]从酱香型大曲中分离得到的霉菌中也发现此种物质[4]。

酸类、醛类、酯类等物质也是大曲中和白酒中的重要呈香物质，其中酯类化合物有花香和水果香，醛类呈现出水果香味[20]。酸类物质中的3-甲基丁酸有水果的香味，Fan等[21]对两种酱香型白酒进行GC-O分析，发现3-甲基丁酸等是闻香强度最高的物质。另外，其他挥发性物质中3-羟基-2-丁酮的含量较高，有奶香味。徐丹等[22]对霉菌研究中发现，霉菌分泌的酶具有良好的蛋白质分解能力，如总状毛霉的蛋白酶活力较高，还可产生酱香风味物质吡嗪类的前体物质3-羟基-2-丁酮。

2.5 霉菌酶活的测定结果

霉菌能够分泌活力高的纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等多种酶，是实现固态糖化发酵的关键微生物，在酒醅发酵过程中具有重要的功能，直接关系到原料的利用及白酒风味的形成，同时对大曲的成熟及风味有积极的贡献[23-25]。

表4 挥发性成分中呈香物质及相对含量

表5 霉菌各种酶活力测定结果 (U/g)

本研究对酱香高温大曲中的霉菌在固态酿造中起主要作用的酶进行了分析，发现黑曲霉的产酶活力都较高，如黑曲霉分泌的中性蛋白酶活力可达2372.57 U/g（表5）。蛋白酶在发酵过程中可以催化生成多种呈香物质，是酱香白酒风味物质及风味前体物质形成的重要酶类[26]。纤维素酶、α-淀粉酶和果胶酶的活力也较高，其中糖化酶的活力可达1059.13 U/g（表5），黑曲霉的糖化酶活力较高，有利于白酒酿造过程中缩短酒精发酵周期，提高酵母产酒能力，加强原料的利用率[27]。另外，黑曲霉是α-淀粉酶与酸性蛋白酶的主要来源，这两种酶能在酿酒的高温及酸或强酸性环境下发挥作用，还能产生活性较高的糖化酶[28]。黄永光等[29]研究发现，河内白曲也常出现在酱香大曲中，通过对它的分泌胞外蛋白进行研究，发现其能分泌酿酒所需的糖化酶、蛋白酶，提升出酒率与酒的品质。

3 结论

本研究采用传统分离霉菌的方法对高温大曲中的霉菌进行分离纯化，成功筛选得到1株产香霉菌，利用形态学、生理生化试验及分子生物学确定这种霉菌为黑曲霉；研究了该株霉菌固态发酵产物中各种挥发性成分以及各种酶的活性，发现酚类物质、醇类物质和呋喃类物质对风味的贡献最大，另外黑曲霉分泌的蛋白酶活力较高，有利于提高高温大曲在酱香白酒过程中的作用。研究结果为下一步探索霉菌在酱香型白酒风味物质形成中所起的作用奠定基础。