微生物实验室常用菌种保存方法及临床意义的探讨

彭敏飞 李洁 贺燕婷 次仁央中 裘淼伟 周芳美*

菌种保存是维持微生物菌种生物特性、活性与遗传特性的技术［1］，基本原理是使菌种的生命活动对能量需求最小，将微生物的代谢限制在最小范围［2］，且菌种在保存的过程中易受到杂菌的污染、基因突变甚至死亡。菌种保存方法多样，最理想的方式为真空冷冻干燥法［3］，但需要特殊设备，技术难度大且较昂贵，一般单位难以实现［2，4］。但在日常工作、质控、比对、教学过程中均离不开对菌种的需要［5］，且保存菌种时要针对不同的菌种保存的时间选用不同的保存方法［6］，为了探究微生物实验室常用菌种的适宜保存方法，为临床提供准确可靠的检验结果。本研究对6种常用的保存方法进行比较，以期为微生物实验室菌种保存方法的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种 由浙江中医药大学医学技术学院医学检验与检疫实验教学中心保存。主要有5类：（1）肠杆菌：变形杆菌、大肠埃希菌、痢疾杆菌、甲型副伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌、伤寒杆菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、摩根摩根菌；（2）葡萄球菌：金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌、白色葡萄球菌；（3）链球菌：甲型溶血型链球菌、乙型溶血型链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌；（4）不发酵革兰阴性杆菌：铜绿假单胞菌、不动杆菌、黄杆菌；（5）真菌：白假丝酵母菌、新生隐球菌、近平滑假丝酵母菌。

1.2 试剂 绵羊血；琼脂粉；液体石蜡；甘油；牛肉浸膏；蛋白胨；血琼脂培养基，营养琼脂斜面培养基，固体培养基，脱脂牛奶，甘油肉汤，液体石蜡，均用常规方法配制，灭菌。

1.3 方法 （1）菌种保存方法：22种菌种每种保存方法各保存40份，其中脱脂牛奶低温冻存法、甘油肉汤法、液体石蜡法3个月、6个月、12个月、18个月复苏菌种，观察复苏情况和生化特征。血琼脂培养基低温保存法、固体培养基低温保存法、营养琼脂斜面培养基低温保存法，1个月、2个月、3个月、4个月复苏菌种，观察复苏情况和生化特征。（1）脱脂牛奶低温冻存法：将新鲜牛奶反复煮沸冷却脱脂，分装于无菌冻存管中［7］，每管1.5ml，挑取纯化后的新鲜菌苔2环于冻存管中，-80℃保存。（2）甘油肉汤法：用无菌涂布棒将需要保存的新鲜菌洗脱在甘油肉汤中，制成菌悬液，移入1.5ml冻存管中，-80℃保存。（3）液体石蜡法：将液体石蜡进行高压灭菌之后，将所要保存的细菌菌落用接种环接种到斜面培养基上，37℃培养24h，将无菌液体石蜡加入斜面培养基，高出培养基1cm进行封口，置4℃冰箱保存。（4）血琼脂培养基低温保存法：将所要保存的细菌四区划线接种到配制好的血琼脂培养基上，37℃培养24h，放入4℃冰箱保存。（5）固体培养基低温保存法：将所要保存的菌种四区划线接种到固体培养基上，37℃培养24h，放入4℃冰箱保存。（6）营养琼脂斜面培养基低温保存法：将所要保存的菌种用接种针接种在营养琼脂斜面培养基上，37℃培养24h，放入4℃冰箱保存。（2）细菌的生理生化反应鉴别：本实验在菌种复苏后对菌种进行了菌种鉴定。菌种经过分离纯化之后，观察菌落形态，通过菌落形态来确定菌种是否发生污染与变异［8］。同时进行了各种生化反应，记录实验结果。

2 结果

2.1 血琼脂低温保存法、固体培养基低温保存法、营养琼脂斜面培养基低温保存法 3种方法第4个月细菌存活率下降至＜50%，甚至降为0%，适合菌种短期内保存。血琼脂低温保存法肠杆菌、葡萄球菌、非发酵革兰阴性杆菌、链球菌第4个月的存活率分别为50%、40%、40%、20%；固体培养基低温保存法、营养琼脂斜面培养基低温保存法肠杆菌肠杆菌、葡萄球菌、非发酵革兰阴性杆菌4个月的存活率分别为 10%、20%、0%。具体结果见表1。

2.2 脱脂牛奶低温冻存法、甘油肉汤法、液体石蜡法 菌种在脱脂牛奶低温冻存下，18个月后菌种存活率为100%。且菌株生长良好，菌落形态正常，适合菌种超长期保存；甘油肉汤法、液体石蜡法两种保存方法6个月内菌种存活率均＞70%，适合菌种长期保存。甘油肉汤法：肠杆菌、葡萄球菌、非发酵革兰阴性杆菌、链球菌、真菌6个月的存活率分别为 90%、80%、80%、80%、70%；液体石蜡法肠杆菌、葡萄球菌、非发酵革兰阴性杆菌6个月的存活率分别为90%、80%、90%。结果见表2。

表1 不同保存方法菌种存活率（%）

表2 不同保存方法菌种存活率（%）

3 讨论

临床微生物实验室是一个专业性很强的特殊实验室，为感染性疾病的诊断、抗生素的合理应用及院内感染的监测与防控提供重要的依据。而微生物实验室在标本检测之前，培养基的生长试验、染色液和手工生化反应的质控、细菌鉴定系统、质谱仪的性能验证等都需要质控菌种进行验证，确认在控后，方可进行检测，以确保结果的准确可靠，及时发送报告至临床科室。质控菌种及部分临床菌种是作为实验室常用菌种，且购买成本昂贵，根据质控频度（每日、每周、每月、年校准）需要选择不同的方法进行保存，常用菌种是否存活是关系临床微生物实验室日常工作是否正常开展的关键。

保存菌种不仅要求菌种存活，还要求其生物学性状、生理特性、抗原性等方面不发生变异，这是保存菌种的重要环节［9］。菌种保存方法多种多样，在应用过程中，应根据实验室不同菌种保藏目的，选取恰当的方法［10］。

本实验中比较了三种低温保存法保存菌种，随着保存时间的延长，每种保存方法下的菌种存活率都有所下降。链球菌保存选用血琼脂培养基低温保存法较好，菌种存活率更高，但容易发生污染，肺炎链球菌保存在血琼脂培养基上则需要2～4d传代一次；斜面培养基和固体培养基低温保存法操作步骤较简便，适合肠杆菌、葡萄球菌和非发酵革兰阴性杆菌短期内保存。血琼脂培养基低温保存法、固体培养基低温保存法和营养琼脂斜面培养基低温保存法适合一般菌种短期内保存，可以随时传代，操作方便，不需要其他设备。但是需要频繁传代，以确保菌种的存活情况，菌种变异的几率较大，而且容易受到污染［11］。液体石蜡法的优点是同时考虑了低温和阻断氧气，从两个方面降低了培养菌种的活性，能够延长菌种的保存时间［12］；甘油肉汤法和液体石蜡法保存菌种相对较好，保存时间长，而且不用频繁传代，易于保持细菌的生理生化特性，受污染的机会也较小［13］。甘油肉汤法前期准备工作较繁琐，液体石蜡法操作简便。脱脂牛奶保存菌种时，虽然前期脱脂牛奶制备工作较繁琐。但菌种保存的时间较长，易于保持菌种的生理生化特性，不容易发生变异，受污染的机会小［14］；为开展实验教学和科研工作使用菌种提供了方便［15］。适合营养要求高且需超长期保存的菌种，如链球菌等。

本实验通过6种菌种保存方法对22种菌种进行保存比较，6种保存方法各有其优缺点。为微生物实验室选用适宜菌种保存方法提供依据。