芪术颗粒对肝纤维化大鼠肝窦内皮细胞整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信号通路的影响*

张 荣 刘绍能 马继征 丁佳媛 刘慧敏 张 玲 路迎冬

中国中医科学院广安门医院 (北京， 100053)

肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤的共同反应，是各种慢性肝病共同病理过程。尽管经过多年的研究，有效和安全地终止或逆转纤维化的治疗仍处于摸索阶段。芪术颗粒在肝纤维化治疗中取得一定疗效，然而肝纤维化的发生机制中有多种细胞因子及多条细胞信号通路参与，其中整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信号转导途径是肝纤维化激活的一条重要信号通路。本研究以芪术颗粒为研究对象，在明确其对肝纤维化有治疗作用的基础上[1,2]，从整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信号转导通路探讨芪术颗粒抗纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠70只，雄性，清洁Ⅱ级，6周龄，体质量180～200 g，由军事医学科学院实验动物中心提供。本院II级动物房分笼饲养，饲以标准大鼠合成饲料，自由饮用大鼠专用无菌水，环境温度(20±2)℃，相对湿度36%。

1.2 药物与试剂 芪术颗粒：本院制剂室提供的中成药(京药制字Z20063189)，临床用量6 g/次，2次/d，日总量12 g，动物与人每公斤体重剂量折算系数是6.25(参考施新猷主编《现代医学实验动物学》)，折算大鼠用药量为1.25 g/kg/d。复方鳖甲软肝片(国药准字Z19991011，内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司生产)功效软坚散结、化瘀解毒、益气养血，用于慢性乙型肝炎肝纤维化以及早期肝硬化属瘀血阻络、气血亏虚兼热毒未尽证者，临床用量2 g/次，3次/d，日总用量6 g，折算大鼠日用药量为0.625 g/kg。四氯化碳(CCl4，分析纯，北京化学试剂公司)，橄榄油(分析纯，北京化学试剂公司)。台盼蓝染色试剂盒(Beyotime，C0011)；SE-1试剂(NOVUS，NB110-68095SS)；CD31试剂(Affinity，AF6191)；整合素ɑVβ3试剂(Abcam，ab52939)。

1.3 主要仪器 病理切片机(德国，LEICA)；台式高速冷冻离心机(湘仪，TGL-16K)；电泳仪(君意，JY300C)；电泳槽(君意，JY-SPDT)；匀浆机(wiggens，D-130)；电转芯(JUNYI，JY-ZY6)；电转仪(六一，DYCP-40E)；酶标仪(EMAXPLUS，E113783)；全自动化学发光图像分析仪(TANON，TANON-5200)；生物倒置显微镜(OLYMPUS，IX71)；FACS流式细胞仪(美国BD公司，C6)；临界点干燥仪(Quorum,K850)；离子溅射仪(IXRF,MSP-2S)；扫描电子显微镜(Hitachi,SU8010)。

1.4 实验方法

1.4.1 制备药物血清 雄性Wistar大鼠50只，分为芪术颗粒高、中、低剂量组、对照组和正常组，每组10只。芪术颗粒中剂量组(简称中剂量组)大鼠以1.25 g/kg剂量的芪术颗粒灌胃；芪术颗粒高剂量组(简称高剂量组)大鼠以2.5 g/kg剂量芪术颗粒灌胃；芪术颗粒低剂量组(简称低剂量组)大鼠以0.625 g/kg剂量芪术颗粒灌胃，对照组大鼠按0.625 g/kg剂量灌胃复方鳖甲软肝片混悬液，均2次/d，连续5天，末次灌胃后1 h于超净台自心脏采血，收集的血液在4℃冰箱垂直静置3 h，在4℃离心机离心3 000 rpm×30 min，后于超净台无菌条件下分离血清并于56℃水浴箱灭活30 min，灭活后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，即制备成芪术颗粒高、中、低剂量组及对照组大鼠药物血清。正常组大鼠用三蒸水灌胃大鼠，余处理均与上述4组相同，获取不含药物的血清。均室温冷却，-20℃冰箱保存备用。

1.4.2 肝纤维化大鼠模型构建 另选雄性Wistar大鼠20只，适应性喂养1周后，随机取14只用10%CCl4橄榄油溶液按3 ml/kg剂量腹腔注射而造模，2次/周。另6只大鼠不造模作为正常对照，两种大鼠均每周称体重1次，依体质量调整造模大鼠给药剂量，连续4周。然后从造模大鼠中随机取2只处死，取肝脏行Masson染色，以验证肝纤维化造模是否成功。造模成功后，分别原位分离造模和正常大鼠肝窦内皮细胞(LSECs)。

1.4.3 原位分离大鼠LSECs 麻醉处死造模和正常大鼠，消毒皮肤后迅速打开腹腔，显露门静脉和下腔静脉；用无菌30G针头插入门静脉，同时剪破下腔静脉；用含有0.5 mol/L EDTA 并且不含Ca2+和Mg2+的HBSS 灌注10 min，速度5 ml/min，然后用含有0.02%Ⅳ型胶原酶并且含有Ca2+和Mg2+的HBSS 灌注10 min，速度5 ml/min。灌注结束后，小心取下肝脏转移至含有5%血清的DMEM 完全培养基中，无菌镊子撕开肝包膜，使肝实质细胞、非实质细胞流出。将收集到的细胞悬液50 g低速离心10 min，收集上清液，400 g离心10 min 收集沉淀，沉淀用DMEM 完全培养基重悬后小心滴加在含有50% percoll和25% percoll离心管中，900 g高速离心20 min(不带刹车)后，在25% percoll和50% percoll之间可见明显的非实质细胞条带，小心将其吸出经DMEM完全培养基重悬后离心洗去残余的percoll液，将非实质细胞悬液加入24孔板并置于细胞培养箱中培养20min，将未贴壁细胞悬液离心后用含有1%内皮生长因子和含有5%血清的内皮细胞培养基(ECM)重悬后按照2×106/ml接种在鼠尾胶原包被的6孔板或96孔板中。在37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。分离出的LSECs经台盼蓝染色及流式细胞术鉴定。

1.4.4 LSECs处理 正常大鼠LSECs添加不含药物的血清(简称正常组)。肝纤维化大鼠LSECs分5种情况添加血清：①添加无药物的血清(简称模型组)；②添加低剂量芪术颗粒药物血清(简称低剂量组)；③添加中剂量芪术颗粒药物血清(简称中剂量组)；④添加高剂量芪术颗粒血清(简称高剂量组)；⑤添加复方鳖甲软肝片药物血清(简称对照组)。血清添加量均为10%，于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换液，培养48h后进行相关指标检测。

1.4.5 检测指标与方法 Western blot检测整合素αVβ3、磷酸化FAK、Ras、磷酸化MAPK蛋白表达。收集细胞用含有蛋白酶抑制剂的裂解液(50 mol/L Tris-Cl pH 7.4, 1 mM EDTA pH 8.0, 250 mol/L NaCl, 1% Triton-X100)进行裂解。蛋白裂解液浓度利用BCA法(Beyotime，P0011)进行测量。10 μg细胞裂解液与5×样品缓冲液(15 g SDS, 15.6 ml 2 M Tris pH 6.8, 57.5 g glycerol, 16.6 ml b-mercaptoethanol)混合后，将样品上样至10%聚丙烯酰胺凝胶中，SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜上(Bio-Rad，No.162-0177)。用含0.1% Tween-20的4%脱脂牛奶进行封闭后，加入抗体，4 ℃孵育过夜。用含0.1% Tween-20的PBS溶液将膜洗3遍后，加入含0.1% Tween-20的4%脱脂牛奶以及HRP二抗(Abcam, ab6721)在室温条件下孵育2h。取出膜，在膜上滴加ECL显影液(Bio-Rad，No.170-5060)并放入GelDoc成像系统(Bio-Rad)进行拍照。ImageJ v1.8.0软件进行灰度分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0软件进行统计学处理，数据用均数±标准差表示，组间数据比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组LSECs 整合素蛋白αVβ3、FAK、p-FAK、Ras、MAPK、p-MARK表达情况 见图1。与正常组相比，其他5组LSECs整合素ɑVβ3蛋白水平均显著升高，MAPK、FAK蛋白磷酸化水平亦均升高。与模型组相比，对照组LSECs αVβ3蛋白水平有所下降，MAPK、FAK蛋白磷酸化表达明显被抑制，芪术颗粒高、中、低剂量组LSECs整合素αVβ3蛋白表达与模型组比较均有下降，MAPK、FAK蛋白磷酸化表达明显被抑制。

图1 6组LSECs整合素αVβ3、FAK、Ras-MAPK蛋白表达图

2.2 6组LSECs整合素αVβ3、磷酸化FAK蛋白表达 见表1。

表1 6组LSECs整合素αVβ3、FAK磷酸化表达比较

2.3 6组LSECs Ras、MAPK磷酸化蛋白表达情况 见表2

表2 6组LSECs Ras、MAPK磷酸化蛋白比较

3 讨论

肝纤维化主要表现为肝组织中细胞外基质(ECM)合成与降解的动态机制失衡，最终导致ECM在肝内病理性沉积。肝星状细胞(HSC)是肝脏损伤后最主要的致纤维化细胞，在各种细胞因子的作用下，活化的HSC通过其自旁、分泌作用，不断地转化为成肌纤维细胞，产生大量的细胞外基质分子，而其降解减少，最终导致肝纤维化的发生[3]。HSC增殖及细胞表型转化、ECM合成增多并沉积同时伴新生血管是进展性肝纤维化修复重建中突出的病理表现，在这过程中整合素发挥重要作用。

整合素是一类细胞黏附分子，主要介导细胞与ECM、细胞与细胞间的黏附和细胞内外的信息传递，调节细胞增值、生长及分化等。整合素αVβ3是多种ECM的受体，主要传递与细胞增殖、分化、运动、分布、定居、生存或凋亡等有关的细胞信号。正常肝组织很少表达整合素αVβ3，但在HSC活化和血管新生时表达上调[4]。近来研究表明在细胞因子刺激下，整合素αVβ3表达上调即是实质损伤后血管重建和疤痕修复反应中关键受体分子，也是HSC活化和血管新生的共同生物标志[5,6]。本研究发现，与正常组比较，模型组LSECs整合素αVβ3表达明显增加，这与文献报道一致。整合素可通过激活与整合素胞质相关的信号蛋白来启动细胞内信号转导[7]，黏着斑激酶(FAK)是一种重要的整合素相关酪氨酸激酶信号蛋白。FAK是由整合素和ECM相互作用引发的信号级联所必需的[8]，与基质结合可导致整合素聚类和酪氨酸397位点的FAK自磷酸化，激活的FAK可以结合并磷酸化其他下游信号分子，最终影响细胞行为。在肝纤维化过程中，LSECs中整合素水平增加，FAK是整合素信号通路中重要的细胞因子，通过调节下游Ras-MAPK途径，参与血管生成[9]，且发挥促进纤维化的作用，其中药物抑制FAK可起到抗纤维化治疗作用[10]。本研究结果提示芪术颗粒抗肝纤维化作用与它对整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信号通路的调控有关。

在以往的临床中，我们发现慢性肝病-肝纤维化-肝硬化这一动态过程与气滞-入络-血瘀动态变化非常相似，故可按络脉理论认识肝纤维化[11,12]。由此提出肝纤维化的病机关键是在毒损肝络的基础上形成“毒瘀肝络”。芪术颗粒由黄芪、莪术、白术、柴胡、茵陈、丹参、桃仁等药物组成，方中黄芪有益气补虚之功；莪术有破血行气，消积止痛之功，取其破血之力以消散肝中之瘀结；白术健脾以助黄芪益气；丹参、桃仁助莪术活血化瘀；茵陈等清热利湿解毒；柴胡等疏肝解郁，理气通络。本方具有益气健脾、化瘀通络、利湿解毒之功效，有较好的抗肝纤维化的作用[1,2]。

我们前期研究证实芪术颗粒可通过调控Angs/Tie-2 mRNA的表达减轻肝窦毛细血管化，影响肝纤维化的形成[13]。又有研究提示，Angs/Tie-2介导的整合素αVβ3信号通路在其中发挥着重要作用[14]。本研究结果提示，芪术颗粒药物血清对LSECs整合素αVβ3及其下游的FAK-Ras/MAPK蛋白表达有下调作用，说明该药减少微血管增生与其抑制LSECs整合素αVβ3-FAK-Ras/MAPK信号通路有关。