ATP合成菌株的构建及用于联合生产S-腺苷甲硫氨酸

江林林 吴磊 许海霞 黄坚丽 张永进 徐期 杨勇

（浙江海正药业股份有限公司，台州 318000）

腺苷三磷酸（ATP）是生物体内重要的代谢物质，作为代谢中间体、辅酶和能量供体参与生物体内多种生化反应，是生命活动及生化反应所必需的高能化合物。在体外，ATP常作为酶反应的辅底物应用于工业产品如谷胱甘肽的生产［1-2]。目前合成ATP的方法有酶催化法、微生物细胞酶系合成法及基因工程菌合成法等，如Maruyama等［3]报道了以腺嘌呤为底物，在产氨棒杆菌催化下合成ATP，反应28 h积累ATP量达到117 mmol/L，底物转化率达到82%；廖鲜艳等［4]报道了以腺苷为底物，利用面包酵母的糖酵解途径耦联腺苷激酶和腺苷酸激酶合成ATP，ATP最高合成量达到9 mmol/L。美国麻省理工学院Whitesides博士的研究组曾报道了一种以乙酰磷酸在腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶3种固相酶的共同作用下将腺苷转化为ATP的方法，产率能达98%以上，具有ATP大量生产的潜力。而国内对此法的研究较少，对于乙酸激酶的研究，则常用于以ATP作为辅底物时的ATP再生［5-6]。

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）是一种广泛存在于生物体细胞中的重要代谢中间体，在体内转甲基、转硫等多种生化反应中发挥着重要作用。目前SAM已经广泛应用于肝病、关节炎、抑郁症等疾病的治疗，疗效好、副作用低［7-8]。在体外采用酶促转化法合成SAM主要是利用腺苷甲硫氨酸合成酶转化ATP和L-甲硫氨酸合成［9-10]。研究过程中发现，由于ATP的价格较高，大大抬高了合成SAM的成本，因此考虑以其他成本低廉的前体物质代替ATP来降低反应的成本。例如，郑计瑞等报道以一株具有转化腺嘌呤生产ATP的毛霉为出发菌株，重组酵母腺苷甲硫氨酸合成酶，以腺嘌呤为前体物质合成腺苷甲硫氨酸，浓度达到1 g/L左右［11]。

本实验首先构建了表达腺苷激酶（Adenosine kinase，AK，EC 2.7.1.20）、腺苷酸激酶（Adenylate kinase，ADK，EC 2.7.4.3）、乙酸激酶（acetate kinase，ACK，EC 2.7.2.1）3种酶的ATP转化菌株，以腺苷和乙酰磷酸二锂盐（以下简称ACP）作为起始物料，合成ATP，并对反应体系进行了优化；再与甲硫氨酸在表达SAM合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，EC 2.5.1.6）的菌体催化下合成SAM。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 pET24a质粒载体购自NOVAGEN公司；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）购自Invitrogen公司。酿酒酵母菌株由本实验室保藏。表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌pET24a-metK，宿主菌为大肠杆菌BL21（DE3）]由本实验室保藏。

腺苷酸激酶基因和乙酸激酶基因来源于大肠杆菌BL21（DE3）基因组序列，腺苷激酶基因来源于酿酒酵母基因组序列，通过PCR获得。PCR引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。

1.1.2 培养基及培养方法 种子培养基（g/L）：酵母膏 5，蛋白胨 10，氯化钠 10。

发酵培养基（g/L）：蛋白胨 15，酵母粉 25，磷酸氢二钾 10，甘油 5，用6 mol/L氢氧化钠调pH至7.5。

在含50 μg/mL卡那霉素的种子培养基中加入1‰甘油冻存管菌液，37℃、220 r/min培养过夜。将种子培养液按2%移种量接种至发酵培养基中，37℃、220 r/min培养约5 h，降温至25℃后加入终浓度为1%的乳糖作为诱导剂，220 r/min发酵过夜。

1.1.3 试剂及工具酶NdeⅠ、BamHⅠ、BglⅡ限制性内切酶、Pyrobest聚合酶、dNTPs、SolutionⅠ、DNA Marker、基因组提取试剂盒等购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司；蛋白质相对分子质量标准购自Thermo公司；卡那霉素、ATP标准品购自上海生工生物工程股份有限公司；SAM标准品购自Sigma；其他分析纯试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重组菌构建 使用基因组提取试剂盒分别提取得到大肠杆菌BL21（DE3）和酿酒酵母的基因组序列，并设计下述PCR引物，分别从大肠杆菌BL21（DE3）中扩增得到腺苷酸激酶基因（gene ID：8156163）和乙酸激酶基因序列（gene ID：8156267），从酿酒酵母中提取得到腺苷激酶基因序列（gene ID：853569）。

腺苷激酶PCR所用引物对为：正向引物：AAA AAAAAAACATATGACCGCACCATTGGTAG，反向引物：AAAAAAAAAAGGATCCCTATTTAGAGTAAGA T。腺苷酸激酶PCR所用引物对为：正向引物：AAA AAAAAAACATATGCGTATCATTCTGCTTG，反向引物：AAAAAAAAAAGGATCCTTAGCCGAGGATTTTT。乙酸激酶PCR所用引物对为：正向引物：AAAAAAA AAACATATGTCGAGTAAGTTAGTAC，反向引物：AA AAAAAAAAGGATCCTCAGGCAGTCAGGCGG。

正向引物中下划线部分表示NdeⅠ酶切位点，反向引物中下划线部分表示BamHⅠ酶切位点。

扩增腺苷激酶基因的PCR扩增反应体系（50 μL）：ddH2O 37.5 μL，10×Pyrobest缓 冲 液 5 μL，dNTP（各 2.5 mmol/L）4 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，模板 1 μL，Pyrobest酶 0.5 μL。PCR 反应条件为 ：95℃ 5 min ；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环 ；72℃ 10 min，16℃ 1 min。

扩增腺苷酸激酶基因的PCR反应体系（50 μL）：ddH2O 37.5 μL，10×Pyrobest缓 冲 液 5 μL，dNTP（各 2.5 mmol/L）4 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，模板 1 μL，Pyrobest酶 0.5 μL。PCR 反应条件为 ：95℃ 5 min ；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃40 s，30 个循环 ；72℃ 10 min，16℃ 1 min。

扩增乙酸激酶基因的PCR反应体系（50 μL）：ddH2O 37.5 μL，10×Pyrobest缓冲液 5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，模 板 1 μL，Pyrobest酶 0.5 μL。PCR 反应条 件 为 ：95℃ 5 min ；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 75 s，30 个循环 ；72℃ 10 min，16℃ 1 min。

将通过上述方法得到的3种酶的编码序列片段进行琼脂糖凝胶电泳，并回收；将回收的三种酶基因的片段和pET24a质粒载体分别用限制性内切酶NdeI于37℃处理3-4 h，再添加限制性内切酶BamH I于30℃处理3-4 h。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用AXYGEN公司的胶回收试剂，盒参考供应商提供的操作手册分别回收经酶切的3种酶的基因片段和pET24a质粒。

首先将上一步处理后的pET24a质粒分别与经酶切、回收的腺苷激酶基因片段、腺苷酸激酶基因片段和乙酸激酶基因片段，利用快速连接酶SolutionⅠ连接3-4 h，后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，分别获得重组质粒pET24a-AK、pET24a-ADK和pET24a-ACK。将上述重组质粒pET24a-AK用限制性内切酶BamH I酶切，30℃酶切3 h后再用碱性磷酸酶（CAP）处理15 min，电泳回收。用BglⅡ与BamH I双酶切处理pET24a-ADK，电泳并回收腺苷酸激酶基因的酶切片段。将如上得到的经酶切的pET24a-AK和腺苷酸激酶基因的酶切片段利用快速连接酶Solution Ⅰ连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得重组质粒pET24a-AKADK。将得到的重组质粒pET24a-AK-ADK用BamHⅠ酶切，30℃酶切3 h后用碱性磷酸酶处理15 min，将酶切产物进行电泳回收。用BglⅡ与BamHⅠ双酶切处理pET24a-ACK，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收乙酸激酶基因的酶切片段。将经酶切的pET24a-AK-ADK和ACK的酶切片段利用快速连接酶Solution Ⅰ连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得重组质粒pET24a-AKADK-ACK。构建的重组质粒pET24a-AK-ADK-ACK的图谱如图1所示。通过测序检测3种酶的表达序列全部正确。

图1 重组质粒pET24a-AK-ADK-ACK

将上述得到的重组质粒pET24a-AK-ADK-ACK用KCM法转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，涂板培养，挑取阳性克隆在LB液体培养基中培养后用终浓度为10%甘油保种，置于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 3种酶的表达及检测 在含50 μg/mL卡那霉素的种子培养基中加入1‰重组大肠杆菌甘油冻存管菌液，37℃、220 r/min培养过夜。将种子培养液按2%移种量接种至发酵培养基中，37℃、220 r/min培养约5 h，降温至25℃后加入终浓度为1%的乳糖作为诱导剂，220 r/min发酵过夜。离心收集菌体并破胞，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组菌对3种酶的表达结果。

1.2.3 重组菌全细胞转化生产ATP及反应条件优化 发酵结束后采用8 000 r/min离心10 min收集菌体，用pH 7.0、50 mmol/L硼砂缓冲液洗涤菌体2次备用。反应体系中含有30 mmol/L腺苷、50 mmol/L硼砂、一定浓度ACP和硫酸镁，加入一定量湿菌体作为酶源合成ATP，对ACP浓度、硫酸镁浓度、菌体用量、反应液pH、反应温度、反应时间等条件进行了优化。

1.2.4 联合生产S-腺苷甲硫氨酸 表达腺苷甲硫氨酸合成酶的菌株（pET24a-metK）由本实验室在前期构建并于-80℃保存，通过以大肠杆菌BL21（DE3）基因组序列为模板PCR扩增得到表达腺苷甲硫氨酸合成酶的基因序列（gene ID：8180558），经NdeI和BamH I双酶切后与载体连接得到重组质粒，转化重组质粒至大肠杆菌BL21（DE3）即得到该菌株。

按照1.2.2所述发酵方法发酵该菌株，8 000 r/min离心10 min收集菌体备用。

在发酵罐中进行5 L体系的反应。先投入5 L ATP反应体系，35℃反应，过程中监测腺苷的转化情况，等腺苷完全转化为ATP后再补加D，L-甲硫氨酸、硫酸镁等其他物料，在表达腺苷甲硫氨酸合成酶的菌体催化下合成SAM。

2 结果

2.1 重组大肠杆菌蛋白表达结果

重组大肠杆菌pET24a-AK-ADK-ACK表达结果如图2-A所示，重组大肠杆菌pET24a-metK表达结果如下图2-B所示，后续将用于考察反应的效果。

图2 重组大肠杆菌蛋白表达结果

2.2 ACP浓度对ATP生成的影响

由于ACP在溶液中易降解，实际使用时需要过量才能使腺苷完全转化，本实验以腺苷浓度为30 mmol/L，分别考察了 ACP浓度为 90、105、120、135、150 mmol/L时的ATP转化率，其他条件为硫酸镁20 mmol/L、菌体浓度为10 g/L（湿重，下同），反应pH为7.5，反应温度为35℃，反应时间为5 h，结果如下图3所示。

从液相分析结果可知，在上述ACP浓度范围内，腺苷均已完全转化，但当ACP浓度低于135 mmol/L时，部分生成ADP，甚至还有少量的AMP存在；当ACP浓度达到135 mmol/L，即腺苷与ACP摩尔比达到1∶4.5时，底物腺苷转化为ATP（以下均称转化率）达到99%以上。

图3 ACP浓度对反应转化率的影响

2.3 硫酸镁浓度对ATP生成的影响

实验中分别考察了硫酸镁浓度为1、5、10、15、20 mmol/L时的ATP的生成率，其他条件同2.2所述，结果如下图4所示。从上述结果可知，当硫酸镁浓度为5 mmol/L时就已经足够使腺苷完全转化为ATP，因此后续实验硫酸镁浓度就采用5 mmol/L。

图4 硫酸镁浓度对反应的影响

2.4 菌体浓度对ATP生成的影响

根据上述实验结果进一步降低菌体用量，分别考察了菌体浓度为1、2、4、6、8、10 g/L时的反应情况。结果如下图5所示。

从上述结果可知菌体的活力较高，在反应体系中用量仅2 g/L就可使底物腺苷完全转化为ATP。

图5 菌体用量对反应的影响

2.5 反应液pH对ATP生成的影响

随着反应的进行，反应液pH会出现下降，下降幅度在1.0左右。为操作便利，在实验过程中不对pH进行调节，因此需考察反应液初始pH的最佳值。实验分别考察了pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5条件下的反应情况，结果如下图6所示。从上述结果可知反应液pH在7.5时ATP的生成率最高，因此在后续的实验中采用反应液初始pH为7.5。

图6 pH对反应的影响

2.6 反应时间对ATP生成的影响

根据上述优化后的反应条件，进一步考察了反应时间为0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h和5 h的反应情况，结果如图7所示。反应时间为2 h时，反应转化率已经达到95%以上；继续反应至3 h，转化率达到99%以上。因此后续均反应3 h。

2.7 放置pH条件对ATP稳定性的影响

ATP料液转化完成后继续放置会有部分重新降解为ADP和AMP，考虑到实际操作过程中存在无法及时处理ATP反应料液的可能性，因此实验考虑将料液加酸，分别考察了pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0条件下室温放置ATP反应液的稳定性，结果如下图8所示。从上述结果可知，在反应结束后放置前6 h，ATP基本都是稳定的；6 h后当料液的pH为3.0、3.5、4.0，ATP基本较稳定，未出现明显的降解；当pH为4.5及5.0时，ATP出现大量的降解，料液中ADP、AMP明显增多，因此后续如需存放ATP料液，可以调节料液的pH为3.0-4.0。

图7 反应时间对反应转化率的影响

图8 反应液放置pH对ATP稳定性的影响

2.8 双菌联合生产腺苷甲硫氨酸

根据上述优化结果，反应体系中含腺苷30 mmol/L、ACP 135 mmol/L、MgSO45mmol/L、硼砂50 mmol/L，重组ATP转化菌株2g/L（湿重），反应液pH为7.5，35℃反应3 h，即可使腺苷完全转化为ATP。

按照上述反应体系配制5 L反应液，在发酵罐中进行控温反应，反应3 h后采用高效液相分析腺苷已经完全转化为ATP，按50 g/L（湿重）补加表达SAM合成酶的菌体均质液，并加入另一底物D，L-甲硫氨酸65 mmol/L，补加硫酸镁15 mmol/L，控温37℃反应，反应过程中检测SAM的生成情况，结果如图9所示。

反应最终生成腺苷蛋氨酸浓度达到8.7g/L，ATP转化率达到72.5%。

图9 SAM生成结果

3 讨论

目前用于ATP生产的主要菌株为酵母菌株及产氨棒杆菌，反应所需的时间较长，而采用重组大肠杆菌用于ATP生产的文献相对较少。本实验构建的ATP转化菌株能够在较低的菌体用量下实现30mmol/L腺苷完全转化为ATP，且反应所需的时间仅需3 h。所用的腺苷浓度相对较低，主要是为了将反应液直接用于下一步S-腺苷甲硫氨酸的合成。后续可以考察更高浓度的ATP合成及ATP的分离纯化，用于ATP的生产。另外，由于ATP反应液中含有较高浓度的醋酸盐，以及过量未参与反应的ACP，可能会对下一步生成SAM产生一定的影响，后续可以考虑先对ATP反应液做一定的处理。以价格较低的腺苷作为底物先合成ATP，再与甲硫氨酸反应合成SAM，可以大大降低SAM的生产成本。

4 结论

构建了重组菌E.coilBL21（DE3）（pET24a-AK-ADK-ACK），催化以腺苷为底物合成ATP，并对反应体系进行了优化，优化后的体系为：腺苷30 mmol/L，乙酰磷酸二锂盐135 mmol/L，硫酸镁5 mmol/L，硼砂50 mmol/L，菌体2 g/L，反应液初始pH为7.5，反应温度为35℃，反应时间为3 h，反应转化率可以达到99%以上。初步考察了联合腺苷甲硫氨酸合成酶合成S-腺苷甲硫氨酸，生成S-腺苷蛋氨酸浓度能达到8.7 g/L，转化率能达到72.5%。