高效严谨型大肠杆菌Targetron基因打靶系统的构建

2019-07-26陈相好刘芳王彩霞陈峥宏洪伟蔡梦迪张峥嵘3綦廷娜廖永慧谷俊莹崔古贞

生物技术通报 2019年6期

陈相好刘芳王彩霞陈峥宏，3 洪伟蔡梦迪张峥嵘，3綦廷娜，3 廖永慧谷俊莹崔古贞，3

（1. 贵州医科大学医学检验学院，贵阳 550004；2. 贵州医科大学基础医学院，贵阳 550025；3. 贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室，贵阳 550025；4. 贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵阳 550004；5. 贵州医科大学附属医院，贵阳 550004）

II型内含子（Group II Intron）是在细菌、古细菌及高等植物细胞器（线粒体、叶绿体）中发现的一类核酶，由内含子RNA和内含子编码蛋白（Intron Encoded Protein，IEP）组成［1-4]。其中，内含子RNA具有核酶活性，通过碱基互补配对原则识别双链DNA；IEP具有反转录酶和DNA核酸内切酶活性，与内含子RNA组装为核糖核蛋白复合体，维持内含子RNA的空间结构，辅助内含子RNA识别靶位点，并发挥核酸内切酶活性切割靶位点，而且IEP能以内含子RNA为模板合成cDNA，从而将内含子RNA以DNA形式插入到染色体靶位点，实现内含子 RNA 的“归巢”［5-9]（图 1）。

图1 II型内含子的“归巢”示意图

来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的Ll.LtrB内含子因其较高的“归巢”效率，已被开发为高效Targetron基因打靶系统，并在革兰阳性细菌（如丙酮丁醇梭菌、解纤维梭菌、艰难梭菌、金黄色葡萄球菌）［10-16]和革兰阴性细菌（如大肠杆菌、绿脓杆菌和根癌农杆菌）［17]等多个细菌中获得广泛应用，尤其适用于难改造的革兰氏阳性厚壁细菌，如肉毒梭菌、艰难梭菌和解纤维梭菌等。该技术在梭菌中也称为Clos tron技术［6]。在前期研究中发现，II型内含子的表达方式对Targetron系统的打靶效率及打靶精度具有很大的影响［18]。如来源于pSY6的Targetron系统，因其II型内含子的表达是受ptb组成型启动子调控，II型内含子在细胞内长期大量存在，使其在解纤维梭菌中存在一定的脱靶现象。当把组成型启动子更换为阿拉伯糖诱导型启动子后，因其表达量和表达模式可以根据需要随时受到调控，其脱靶现象大幅度降低［18]。因此，构建不同的诱导型Targetron系统可以提高其打靶效果。

本研究将来源于Ll.LtrB的II型内含子置于T7-lac操纵子控制之下，构建了IPTG诱导型Targetron质粒，并通过优化诱导剂浓度和诱导时间，在大肠杆菌中建立了诱导型Targetron体系，旨为II型内含子的机理研究和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基及培养方法大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）均用37℃在LB培养基中进行培养，LB液体培养基的配制：1% TRYPTONE、0.5% YEAST EXTRACT、1% NaCl，在LB液体培养基中加入1.5%的Agar Powder成为LB固体培养基。质粒构建及II型内含子诱导表达所用氨苄青霉素的筛选浓度为100 μg/mL，蓝白斑筛选时，在LB固体培养基中加入氨苄青霉素（100 μg/mL）、X-gal（40 μg/mL）和 IPTG（0.1 mmol/L）。

1.1.2 主要试剂高保真DNA聚合酶、DNA marker、T4 DNA连接酶购自北京全式金生物技术有限公司，Taq DNA 聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司，限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific，Gibson组装试剂盒购自NEB，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根公司，IPTG、X-gal、氨苄青霉素购自北京索莱宝公司，引物合成及测序由上海生工完成。

1.1.3 引物本研究所用到的引物详见表1。

1.1.4 菌株及质粒本研究中用的菌株及质粒详见表2。

表1 本研究所用到的引物

表2 本研究所用到的菌株及质粒

1.2 方法

1.2.1 打靶引物设计以大肠杆菌lacZ基因为靶基因，利用在线网址（www.clostron.com），结合评分高低，选择lacZ基因正义链第635位点（lacZ-635s）和反义链第1063位点（lacZ-1063a）作为打靶位点，每个打靶位点软件会给出4种引物（IBS、EBS1d、EBS2、EBS Universal），设计获得的引物序列详见表1。

1.2.2 IPTG诱导的Targetron打靶质粒构建以pET28a载体为模板，lacI-T7-F和lacI-T7-R为引物，PCR扩增lacI-T7片段。利用Gibson组装试剂盒将lacI-T7扩增产物与XmaI/XhoI双酶切的pSY6载体组装，获得IPTG诱导型Targetron载体pSY7（图2）。

通过重叠延伸PCR方法构建内含子RNA打靶识别片段，用XhoI和BsrGI双酶切PCR产物和pSY7质粒，T4 DNA连接酶连接得到两个位点的特异性打靶质粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a，详细构建流程如图2所示。

1.2.3 大肠杆菌BL21（DE3）的转化利用热激法将质粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a转入BL21（DE3）感受态细胞，置于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、180 r/min过夜培养。

1.2.4 IPTG浓度对Targetron打靶效率的影响取40 μL过夜培养的菌液加入到4 mL的LB液体培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素），37℃、200 r/min培养1 h，加入不同终浓度的IPTG置于37℃、200 r/min培养45 min，离心收集细胞沉淀，稀释后涂布LB固体培养基（含氨苄青霉素100 μg/mL、X-gal 40 μg/mL、IPTG 0.1 mmol/L），37℃过夜培养，通过蓝白斑计数计算其打靶效率。

1.2.5 诱导时间对Targetron打靶效率的影响加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG进行不同时间的诱导，通过蓝白斑计数计算其打靶效率，其余操作同1.2.4。

2 结果

2.1 IPTG诱导的Targetron质粒构建

IPTG诱导的pSY7质粒详细构建流程如图1所示。pSY7质粒经XmaI/XhoI双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测，可见清晰的约1.7 kb大小的电泳条带（图3），与预期结果一致，表明诱导型Targetron质粒构建成功。

图3 质粒pSY7酶切验证及琼脂糖凝胶电泳检测

2.2 lacZ-635s和lacZ-1063a位点的打靶质粒构建

利用重叠延伸PCR方法，以设计的lacZ-635s和lacZ-1063a两个位点的特异引物为引物，以Targetron载体指导RNA序列为模板，扩增lacZ-635s和lacZ-1063a两个位点的特异性打靶片段。图4-A表示第一轮PCR扩增结果，琼脂糖凝胶电泳显示，分别获得打靶序列上游约0.25 kb和下游约0.1 kb的片段；图4-B表示第二轮PCR扩增结果，琼脂糖凝胶电泳显示获得0.35 kb特异性条带。然后，分别用XhoI/BsrGI双酶切第二轮PCR产物和pSY7载体，T4 DNA连接酶连接后获得特异性打靶载体pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a。双酶切验证与预期结果一致（图4-C）；最后，通过测序进一步证实两个位点的打靶载体均构建成功。

图4 Targetron载体构建及酶切验证

2.3 IPTG诱导型Targetron打靶系统严谨性分析及功能验证

将打靶质粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a分别转化大肠杆菌BL21（DE3），复苏后直接涂布LB平板，过夜培养后分别挑取单菌落进行菌落PCR验证。结果表明，未经诱导的Targetron质粒涂平板后获得的菌落均是野生型，表明本研究构建的Targetron系统具有较好的严谨性。

同时，进行平行试验，将转化后的大肠杆菌首先经0.2 mmol/L IPTG诱导1 h，稀释后涂布LB固体培养基（含氨苄青霉素 100 μg/mL、X-gal 40 μg/mL、IPTG 0.1 mmol/L），过夜培养后，分别挑取平板上的白色菌落和蓝色菌落进行菌落PCR验证。结果如图5所示：当用打靶位点上下游引物进行PCR扩增验证时，突变株得到约1.9 kb的PCR扩增条带，而野生型对照菌株得到约1.0 kb的PCR扩增条带（图5-B）。当利用插入序列的内侧引物和外侧引物进一步进行PCR验证时，两种突变株均得到0.65 kb和1.6 kb的PCR扩增条带（图5-C）。总之，上述结果表明，本研究成功构建IPTG诱导型Targetron打靶系统。

图5 Targetron基因打靶系统的功能验证

2.4 IPTG浓度对打靶效率的影响

质粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a分别转化大肠杆菌BL21（DE3），使用不同浓度的IPTG分别诱导45 min。结果（图6）显示，在没有IPTG诱导时，两种质粒的打靶效率均为0，随着IPTG浓度的提高，其归巢效率也逐步提高，当IPTG浓度达到0.5 mmol/L时，两种质粒的打靶效率达到最高值，达到90%以上。

图6 IPTG浓度对归巢效率的影响

2.5 IPTG诱导时间对打靶效率的影响

质粒pSY7-lacZ-635s和pSY7-lacZ-1063a分别转化大肠杆菌BL21（DE3），用0.5 mmol/L的IPTG分别诱导15 min、30 min、45 min、60 min。如图7所示，两种质粒的打靶效率随着诱导时间的增加而增加，当诱导时间达到45 min时，两种质粒的打靶效率达到最大值。

图7 诱导时间对归巢效率的影响

3 讨论

来源于乳酸乳球菌的LtrB内含子，在内含子编码蛋白的辅助下，成为高效可移动的元件。由于II型内含子通过IEP及内含子RNA共同识别目标DNA序列，利用Targetron在线设计网址找到潜在内含子识别位点，结合PCR技术对内含子RNA修饰改造，从而实现内含子RNA的特异性“归巢”，基于此建立的基因打靶技术被广泛应用于原核生物的遗传改造，展现了可观的应用前景。有研究人员借助Targetron技术得以在包含毒性因子［19-21]、潜在药物靶点［22-23]等方面深入研究。选择Targetron设计网址得到的较高得分的潜在插入位点，可防止II型内含子的脱靶，并且不需要遗传筛选标记，通过克隆PCR能轻易地筛选到突变菌株。

然而，无论在何种微生物中应用，II型内含子的长期表达和大量积累均会降低其打靶精度，不利于其后续的遗传筛选。本研究建立的IPTG诱导型基因打靶系统，利用T7-lac操纵子与内含子组装，实现了Targetron系统在大肠杆菌中的可控诱导表达，而且可以根据需要，调控Targetron系统的表达模式，如在何时需要II型内含子表达、II型内含子的表达的强度是多少等，从而实现对靶基因的精确调控。

目前常用的基因打靶技术如基于同源重组原理的RecA系统和Red系统，其重组效率较低，需要进行多次转化和筛选方可获得突变株，实验周期较长［24]。基于DNA断裂损伤、激发机体修复机制的基因编辑方法如锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）技术和类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技术，该技术具有靶向精确、细胞毒性低等优势，已在多个物种中获得广泛应用。然而，该技术均以蛋白作为向导，需要构建复杂的载体系统，技术难度较大，成本较高［25]。此外，CRISPRCas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9 system）技术是目前应用最广泛的基因编辑技术，该技术以RNA为向导，仅需改变约20 bp的RNA序列即可实现不同基因的打靶，具有效率高、成本低、操作方便等优势，但仍存在一定的脱靶风险［25]。本研究中采用的Targetron基因打靶技术是基于细菌II型内含子的“归巢”原理而设计，该技术以内含子RNA为向导，通过改变内含子RNA的序列实现不同基因的打靶，具有效率高，操作方便等优势，尤其适用于微生物的遗传改造。本研究将T7-lac操纵子与Targetron基因打靶系统联合，成功构建诱导型Targetron系统，极大地缩短了实验周期，提高了工作效率。

本研究中建立的方法由于采用的是T7-lac操纵子启动内含子RNA及内含子编码蛋白的表达，而T7启动子需要和T7 RNA聚合酶相互识别才能发挥功能，并且在不同的微生物中，需要不同的复制元件，故本研究建立的方法限于编码T7 RNA聚合酶的大肠杆菌系统。但是通过在质粒上构建T7 RNA聚合酶的序列及更换合适的复制元件，便可用于其他微生物的遗传改造。总之，本研究建立的诱导型Targetron技术，为II型内含子的功能应用与机理研究奠定了基础。