m6A RNA甲基化在肿瘤发生发展中的作用

龙文林 郭辉 盛杰 宋如晦 徐瑶

（武汉科技大学生命科学与健康学院 生物医学研究院，武汉 430081）

早在20世纪70年代，科学家们就发现了N6-甲基腺苷（m6A）修饰，m6A是能够发生在mRNA、长链非编码RNA（lncRNA）等RNA腺嘌呤（A）上的甲基化修饰［1]。在目前已知的171种RNA转录后修饰中［2]，m6A是大多数真核生物mRNA和lncRNA中最丰富的修饰之一，占哺乳动物RNA中腺苷酸的0.1%-0.4%和核糖核苷酸总甲基化的50%［3-4]。除了在植物和脊椎动物中存在着广泛的m6A修饰外，在单细胞生物如细菌、酵母等RNA中也发现了这种修饰［3，5-8]。m6A修饰主要发生在RRACH（R = G或A，H = A，C或U）共有序列中［9-11]，通过高通量测序发现，m6A并不是随意分布，而是在终止密码子、3'非翻译区（3'UTR）、和内部长外显子聚集［12-14]，并且在前体mRNA中发现的更多［15-16]。类似于DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传修饰，m6A甲基化参与众多细胞活动中重要功能基因复杂而精细的生物学调控，越来越多的研究表明，m6A修饰参与了人类复杂疾病的发生过程，尤其在癌症的发生发展中扮演着重要的角色。本文综述了m6A甲基化修饰的机制及其生理学意义，重点总结了其在不同肿瘤发生发展中的作用，旨在为癌症的早期诊断、治疗和预后提供新的研究策略。

1 m6AmRNA甲基化的调节机制及其生理学意义

通过对m6A相关蛋白的研究发现，m6A甲基化是一个动态可逆的过程［17]，它由甲基转移酶复合体（Writers）、脱甲基酶（Erasers）和功能管理者（Readers）组成（图1）。Writers是将甲基化修饰“写入”RNA，即介导RNA的甲基化修饰过程。根据目前文献报道，至少有以下7个成分组成了该复合体，METTL3/METTL14/WTAP/RBM15/KIAA1429/HAKAI/ ZC3H13。其中，最常见的分子是METTL3和METTL14，两者可在体外和体内催化mRNA（和其他细胞核RNA）的m6A甲基化［18-19]。WTAP是这种甲基转移酶复合体中的另一个关键组分［20]。METTL3充当催化核心，将甲基从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移至受体腺嘌呤部分。METTL14作为RNA结合平台，促进RNA底物的结合并增强复合物的稳定性。METTL3-14复合二聚体诱导核RNA上的m6A沉积。METTL14的催化甲基化活性约为METTL3的10倍，WTAP不具有甲基转移酶活性，然而，它与METTL3-14复合物相互作用以影响体内m6A甲基转移酶活性和甲基化位点的准确定位［21]。RNA结合基序蛋白15（RBM15）有助于将复合物募集到其靶位点。KIAA1429（也称为VIRMA）参与特定位点的METTL3-METTL14-WTAP募集，HAKAI也是甲基转移酶的重要组成部分［22]。锌指CCCH型13（ZC3H13）起着在细胞核中锚定WTAP、Virilizer和Hakai，以促进m6A甲基化的作用［23]。此外，有文献报道，甲基转移酶样蛋白16（METTL16）被认为是用于修饰U6 snRNAs和各种非编码RNA的甲基转移［24-25]。Erasers能够将RNA甲基化修饰信号“擦除”，即介导RNA的去甲基化修饰过程。脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）和AlkB同源物5（ALKBH5）是目前已知的两种m6A去甲基化酶，FTO是Fe II /α-酮戊二酸依赖性双加氧酶AlkB亚家族的成员，它们是Fe（ii）和α-酮戊二酸依赖性的，使用亚铁作为辅因子和α-酮戊二酸作为共同底物将m6A位点的N-甲基氧化成羟甲基，沉默或过表达FTO/ALKBH5都能改变细胞中m6A的水平［17，26-27]。Readers是负责“读取”RNA 甲基化修饰的信息，并参与下游RNA的翻译、降解等过程。其“读取”方式有两种模式，一种是直接阅读，是指直接与RNA的m6A位点的选择性结合。具有RNA结合结构域的YTH结构域家族是第一个被发现直接阅读的“读者”［28]，YTH（YT521-B同源性）家族蛋白YTHDF1-3和核成员YTHDC1和YTHDC2可直接结合含有m6A的RNA。YTHDF1促进m6A甲基化mRNA的翻译，YTHDF2加速m6A甲基化mRNA的衰变，YTHDF3与YTHDF1和YTHDF2一起能显著增强细胞质中m6A甲基化mRNA的代谢，YTHDC1通过促进SRSF3同时抑制SRSF10，从而影响mRNA剪接［21]。YTHDC2可提高翻译效率并降低mRNA的丰度［29]。此外，不用于YTH结构域家族，RNA结合蛋白异质核蛋白A2B1（HNRNPA2B1）和真核转录起始因子3（EIF3）也能与RNA的m6A位点直接结合，HNRNPA2B1能结合到细胞核中的一部分miRNA转录本，并与DGCR8蛋白（pri-miRNA微处理器复合物的一个组成部分）相互作用，起到调节剪接和miRNA成熟的作用［30]。EIF3能与m6A位点直接结合，以促进不依赖帽的翻译。另一种模式是间接阅读，即m6A修饰改变RNA二级结构。这些结构改变促进几种蛋白质的结合：异质核核糖核蛋白C（HNRNPC）和异质核核糖核蛋白G（HNRNPG）结合，负责pre-mRNA加工和mRNA成熟［31]。最近有研究发现了m6A的新的“读者”——胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白（IGF2BPs，包括IGF2BP1/2/3），能够识别共有序列GG（m6A）C从而靶向mRNA转录本，以促进mRNA的稳定性和翻译［32]。随着这些m6A重要的功能组成成分的不断发现，对m6A甲基化修饰和调控功能的认识得到了极大的丰富，未来仍有广阔的探索前景去更全面、更深入的了解m6A甲基化。

如上所述，m6A在“Writers”的作用下，在RNA上加入甲基，通过不同的“Readers”来识别那些m6A修饰的RNA产生不同的功能，包括RNA加工、核输出、翻译、衰变等。最后，依靠“Erasers”的作用让m6A修饰这一过程变得动态、可逆，从而起到调节各种基因的表达的功能。也正是这种模式使得m6A甲基化修饰在生理过程中发挥了重要的作用。目前，越来越多的证据表明m6A甲基化修饰在生物钟的控制［33]、精子的产生［34]、胚胎的发育［35]、维持胚胎干细胞多能性［36]、果蝇的性别决定［37]、T细胞的稳态［38]、热休克反应［39]和调节心脏收缩功能［40]等过程中发挥了重要作用。同时，由于RNA调节与人类疾病息息相关，作为哺乳动物细胞中最丰富的内部修饰之一，m6A甲基化修饰被证实与多种疾病如肥胖症［41]、Ⅱ型糖尿病［42]、不育［27]和神经元疾病［43]等有关。其中，研究的热点领域还是m6A甲基化修饰与肿瘤之间的关系，也是本文重点所在。

图1 m6A甲基化修饰的分子机制

2 m6A mRNA甲基化修饰在肿瘤中发生发展中的作用

目前，m6A mRNA甲基化与肿瘤之间的研究受到广泛关注，越来越多的证据表明，m6A mRNA甲基化与肿瘤的发生发展密切相关，m6A相关蛋白是肿瘤发生发展中的重要调节因子，其表达水平的高低往往直接决定了肿瘤的病理学进程。在不同类型的肿瘤中，m6A修饰既可以致癌，也可以抑癌（表1）。因此，研究m6A调控的基因在不同癌症中的生物学功能，鉴定关键的m6A靶基因，对于了解癌症发病机制具有重要意义。

2.1 m6A与胶质母细胞瘤（GBM）

胶质母细胞瘤是最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，即使联合采用手术切除、放射治疗、化疗等手段，患者诊断后存活率依然较低，且复发率高，平均生存期约为14.6个月，被世界卫生组织（WHO）评为IV级胶质瘤［44]。胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）是一种具有促进肿瘤生长和侵袭能力的癌症干细胞，并对化疗和放疗具有很强的抵抗能力，这些特性成为了胶质母细胞瘤治疗差的主要原因。近几年的研究发现，GBM与m6A修饰有着密切联系。在初级GSCs中，mRNA上的m6A水平明显降低，而当GSCs被诱导分化时，m6A水平增加。抑制METTL3或METTL14的表达能减少m6A水平，增强GSCs的体外生长和自我更新，并促进GSCs在体内形成肿瘤的能力。与此相反，METTL3的过表达或FTO抑制剂MA2能增加GSCs中m6A水平，抑制GSCs的增长和减缓肿瘤的发生发展。更重要的是，研究发现，在PBT003细胞系中，METTL3或METTL14的敲低导致了几种癌基因（如ADAM19，EPHA3和KLF4）表达上调和肿瘤抑制因子（如CDKN2A，BRCA2和TP53I11）下调。相反，METTL3的过表达或用FTO抑制剂MA2处理导致上述癌基因的表达降低［45]。另一项研究表明，m6A去甲基化酶ALKBH5在GSCs中呈高表达，抑制ALHKBH5会减少GSCs的自我更新、增殖和肿瘤的发生。ALKBH5使FOXM1（FOXM1是细胞周期调控中的关键转录因子，并且在GSCs的自我更新和肿瘤发生中起关键作用）新生转录物去甲基化，通过结合3'UTR增强FOXM1表达，而FOXM1的核lncRNA FOXM1-AS（核lncRNA反义物）能进一步促进FOXM1新生转录物与ALKBH5的相互作用从而加强这一过程。敲除FOXM1-AS也会破坏GSC中的FOXM1表达和自我更新，并且在耗尽ALKBH5或FOXM1-AS后，通过过表达FOXM1能挽救GSC的肿瘤生长，进一步证明了FOXM1在GSC肿瘤发生中的关键作用［46]。因此，m6A甲基化和去甲基化能够通过不同的调节机制影响胶质母细胞瘤中GSCs，从而对GBM的发生发展发挥了关键作用，为胶质母细胞瘤提供了新的治疗靶标。

表1 m6A修饰相关蛋白表达水平与肿瘤发生发展

2.2 m6A与急性髓性白血病（AML）

急性髓系白血病（AML）是成人中最常见的急性白血病，占该组病例的约80%，具有较高的死亡率。AML是一种高度异质性的疾病，其生物学特征在于分化阻滞，增殖增加和细胞凋亡抑制。其发病机制在很大程度上取决于不同体细胞改变和染色体重排之间的相互作用，不同的细胞遗传学异常t（8；21）（q22；q22），inv（16）（p13q22）/ t（16；16）（p13；q22），t（15 ；17）（q22 ；q11～21） 和 abn（11q23）和分子异常（FLT3-ITD，MLL PTD和NPM1突变）显示出不同的发病机制［47]。AML是METTL3和METTL14表达水平最高的癌症之一，与正常造血祖细胞相比，发现METTL3和METTL14在AML细胞中呈高表达，METTL3和METTL14在AML具有一致的致癌作用［48-49]。METTL3通过增加靶基因c-MYC（髓细胞瘤病），BCL-2（B细胞淋巴瘤2），PTEN（磷酸酶和张力蛋白同源物）的表达来抑制细胞分化和凋亡，并促进细胞增殖，并且PTEN转录物可编码p-AKT的负调节物，通过激活PI3K/AKT途径以促进分化并抑制自我更新［50]。METTL14在正常骨髓细胞生成中起抑制作用，而在AML中抑制细胞分化。在SPI1-METTL14-MYB / MYC轴中，METTL14被SPI1下调，通过m6A修饰调节MYB和MYC，在增强白血病造血干/祖细胞（HSPCs）自我更新和抑制骨髓分化中发挥致癌作用［49]。此外，WTAP作为m6A“Writers”的另一名成员，被证明与AML有关，WTAP也被描述为AML的新型致癌蛋白。与正常外周血单核细胞以及AML细胞系相比，AML中WTAP水平增加。升高的WTAP促进细胞增殖并抑制AML的细胞分化［51]。其中调节机制还有待进一步研究。脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）作为m6A修饰的重要一员，在造血细胞转化中发挥着重要作用。已经报道了在AML某些亚型中，如t（11q23）/ MLL-重排，t（15；17）/ PML-RARA，FLT3 -ITD 和 /或 NPM1突变的亚型，FTO的表达升高，显著促进AML细胞的存活和增殖，并抑制人AML细胞的分化和凋亡，并且高表达FTO显著促进小鼠白血病的发生，当FTO的内源性表达耗尽时，情况正好相反。这是FTO通过靶向其UTR降低一组肿瘤抑制靶基因（如细胞因子信号传导盒-2（ASB2）抑制因子和视黄酸受体α（RARA））的m6A水平，从而影响它们的稳定性［52]。此外，有研究发现，突变体异柠檬酸脱氢酶1/2（IDH1/2）产生大量的R-2-羟基戊二酸（R-2HG）作为代谢物，可通过抑制FTO活性增加m6A水平，导致MYC致癌基因和转录因子CEBPA mRNA稳定性降低，从而抑制白血病细胞增殖和降低其活力，并促进细胞周期停滞和细胞凋亡［53]。FTO作为脱甲基酶，目前在AML中的研究还处于起步阶段，其具体的分子机制及下游调控基因还有待进一步阐明。与其他的表观遗传修饰相比，AML中的m6A修饰活性很容易被化学药物所靶向，能够为AML的新药研发提供理论依据。

2.3 m6A与肝细胞癌（HCC）

HCC是一种主要的原发性肝癌，占全球恶性肿瘤发病率的第五位［54]，由于缺乏有效的干预措施，导致HCC的转移和复发，使得HCC的发病率和死亡率逐年增加，因此我们需要深入研究癌症进展的分子机制。越来越多的证据表明，肝癌的发生是一个涉及遗传学、表观遗传学和转录变化之间复杂相互作用的多步骤过程［55]。转录组测序（RNA-Seq）结果显示，METTL3在人肝癌细胞中被表达显著上调，METTL3的过表达能够促进HCC增殖和迁移，并显著增强HCC的肿瘤形成。细胞因子信号传导抑制因子2（SOCS2）作为METTL3的下游靶标，同时也是肿瘤抑制因子，METTL3通过m6A-YTHDF2依赖途径降低SOCS2 mRNA稳定性从而促进HCC的发生与发展［56]。Zhao 等［57]发现 YTHDF1 的表达水平与HCC患者的病理进程有关，低表达YTHDF1的患者表现出更高的生存率。此外，YTHDF2与HCC的恶性程度密切相关，通过识别m6A位点来调节mRNA降解，导致HCC细胞增殖的增强，有研究发现，HCC患者中下调的miR-145可以通过直接靶向YTHDF2 mRNA的3'UTR来抑制YTHDF2的表达，可能成为肝癌治疗的新的靶标［58]。而在另一篇报道中发现，相比于邻近组织和正常肝组织，HCC中m6A水平是降低的。同时METTL14和FTO在HCC中均降低，而METTL3、WTAP、KIAA1429和ALKBH5没有显著变化。临床数据显示，METTL14减少的患者表现出更低的生存率。METTL14缺乏增强了HCC细胞的转移能力，相反，METTL14的过表达抑制了细胞迁移和侵袭。进一步的实验表明，METTL14可通过介导微处理蛋白（DGCR8）与pri-miRNA的识别和结合，促进pri-miR126加工成miR126，而miR126被鉴定为肿瘤转移抑制因子［59]。这些研究都表明m6A修饰在HCC发生发展中具有重要作用。

2.4 m6A与乳腺癌

乳腺癌是所有女性恶性肿瘤中发病率最高的癌症，尽管乳腺癌早期治疗效果较好，但转移后治疗效果较差，具有高复发率和高死亡率。乳腺癌干细胞（BCSCs）是一组通过自我更新能够无限增殖的亚群细胞。只有BCSCs可形成复发性或转移性肿瘤［60-61]。乳腺癌细胞在缺氧环境中会增加乳腺癌干细胞（BCSCs）的比例，这是肿瘤起始和转移所必需的条件，并且这种反应取决于缺氧诱导因子（HIF）的活性。HIF依赖性ALKBH5通过去甲基化增强多能性因子NANOG mRNA的稳定性，ALKBH5的过表达促进了BCSC中NANOG的表达和BCSC的富集，ALKBH5基因敲除可抑制肿瘤形成，减少体内BCSCs［62]。同时HIF还通过ZNF217（一种m6A甲基转移酶抑制剂）和ALKBH5介导的乳腺癌细胞RNA甲基化来调控其他多能因子表达。ZNF217与ALKBH5相互作用并抑制多能性因子NANOG和KLF mRNA甲基化，最终导致KLF4和NANOG表达升高，从而促进肿瘤发生［63]。这些多能性因子的表达均依赖于HIF，有望成为乳腺癌治疗的新的切入点。另一项研究显示，在临床乳腺癌样品中METTL3的表达水平很高，乙肝病毒X蛋白结合蛋白（HBXIP）与METTL3之间相互作用，METTL3、HBXIP和miRNA let-7g之间形成一个正反馈环（HBXIP/let-7g/ METTL3/HBXIP），以促进乳腺癌细胞的增殖。 HBXIP通过抑制肿瘤抑制因子let-7g增强METTL3的表达。METTL3的增加反过来又通过促进mRNA中m6A的修饰来提高HBXIP的水平［64]。体内、体外实验均证实，METTL3和ALKBH5能够通过调节m6A的甲基化修饰水平，进而促进乳腺癌细胞的增殖和迁移，由此可见，调控m6A修饰可逆性的两种蛋白（“Writers”和“Erasers”）在癌症发生发展过程中具有相同的作用。目前，关于“Readers”在乳腺癌中的研究尚未见报道，存在很大的研究和探索空间。

2.5 m6A与肺癌

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，包括小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其中NSCLC约占85%，尽管目前肺癌的诊断和治疗手段不断提高，但5年生存率仍较低［65-66]。有研究发现，METTL3能促进EGFR、TAZ、MAPKAPK2（MK2）和DNMT3A等癌基因mRNAs的翻译，且与甲基转移酶活性无关。METTL3在肺腺癌中的表达较高，能促进人肺癌细胞的生长、存活和侵袭［67]。另一项研究发现，miR-33a通过靶向METTL 3 mRNA 3‘UTR结合而抑制NSCLC细胞的增殖，提示METTL3可能是非小细胞肺癌治疗的新靶点［68]。最近，又有研究者发现，m6A脱甲基酶FTO通过调节髓样锌指1（MZF1）的表达，促进肺鳞状细胞癌的进展，MZF1是SCAN-Zinc Finger（SCAN-ZF）转录因子家族的成员之一，通过调节其在不同类型癌症中的多种靶基因，促进细胞的增殖、迁移和转移。FTO通过降低MZF1mRNA转录本中m6A水平和mRNA稳定性而增强MZF1的表达，从而产生致癌作用［69]。m6A修饰关键酶调控的靶基因在不同癌症类型中有所不同，因此，筛选m6A修饰的下游关键基因对于阐明肿瘤发生发展的分子机制及未来的临床治疗都至关重要。尽管在肺癌中已有部分靶基因被揭示，但是其功能还需通过体内实验进一步证实。

3 结语

在过去几年中，由于高特异性抗体的可用性和高通量测序技术的可及性，鉴定m6A RNA甲基化的化学基础和多种功能已经成为可能。尤其是m6A IP（交联和免疫沉淀）和RNA-seq技术的快速发展，m6A已被证实参与了多种恶性肿瘤的发生发展。这将使得m6A相关酶或m6A依赖途径的靶向成为可能，从而为m6A靶向治疗人类癌症提供了重要的科学依据。然而，尽管m6A在癌症中的作用已经逐渐被揭示，但仍然存在着许多挑战。首先，某些肿瘤中m6A调节因子的机制在很大程度上是未知的，比如m6A甲基化修饰中“Readers”在癌症中的作用和机制仍然是个很大的空白；其次，虽然很多研究显示，m6A相关调节因子和作用途径可作为癌症治疗中的新的靶点，但缺乏一定的临床实践，而m6A在许多方面都能影响基因的表达，其副作用也不可忽视。未来的工作，旨在深入研究m6A修饰中的“Writers”、“Erasers”和“Readers”参与疾病进程调节的分子机制，结合临床数据评估m6A与疾病的相关性，进一步增强我们对肿瘤恶性转化的理解，并有助于设计新的癌症治疗药物。