3种猴头菇不同成熟度子实体的抗氧化活性

吕国英，张作法*，陈建飞，毛荣良，刘世柱

(1.浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州 310021； 2.衢州菇乐农业开发有限公司，浙江 衢州 324000；3.常山县森力家庭农场，浙江 常山 324200； 4.浙江方格药业有限公司，浙江 庆元 323800)

猴头菇(Hericiumerinaceus)又名猴头菌、刺猬菌，是一种大型的食药用真菌，因其形状酷似金丝猴头，而得名。猴头菌的食用历史悠久，营养丰富，主要活性成分有多糖、低聚糖、萜类和酚类等，具有抗癌、护胃、提高免疫力等多种药理功效[1-2]。有关猴头菇的功能性成分研究中，多糖护胃活性最受关注[3]，猴头菇的抗氧化活性研究较少。

自由基是在生物体内呈游离状态带有不成对电子的分子、原子或离子。大量研究表明，氧自由基诱导的LPO反应与许多疾病的发生有密切的关系[4]。因此，寻找利于人体吸收的能清除体内过量自由基的外源活性自由基清除剂，成为人们关注的重点。本研究以抗氧化活性为指标，选取不同品种不同成熟度猴头菇子实体，制备出具有优良抗氧化活性的提取物，同时为猴头菇功能食品的开发提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

猴头菇1号、2号、99号不同生长时期的子实体由常山县森力家庭农场提供。DPPH、ABTS、过硫酸钾购自Sigma，其他试剂为分析纯。

1.2 样品制备

选取猴头菇1号、2号、99号3个品种不同生长时期的子实体(A未成熟，B成熟，C过熟)，60 ℃烘干粉碎过60目筛，备用。

取3.0 g猴头细粉，加入100 mL 70%乙醇，90 ℃回流1 h，离心收集上清液，残渣再次加入100 mL 70%乙醇，再次回流1 h。合并提取液，10 000 r·min-1离心5 min，取上清液旋蒸，得到醇提物，4 ℃下保存。测定时，取醇提物用70%乙醇配制成1～5 mg·mL-1的样品待测液。

1.3 DPPH自由基清除率的测定

1 mL样品待测液加入1 mL 0.01%的DPPH乙醇溶液，振荡反应30 min后，在517 nm处测定吸光度。以70%乙醇溶液代替同样体积的样品作为空白，计算DPPH清除率[5]。

1.4 ABTS+清除率的测定

配制7 mol·L-1ABTS储备液(2.46 mol·L-1过硫酸钾溶液溶解ABTS)，室温避光条件下静置12～16 h；将ABTS以磷酸缓冲液(10 mmol·L-1，pH值7.4)稀释，使其吸光度在734 nm处达到0.70±0.02。然后取2.5 mL的ABTS+测定液，加入1.0 mL的样品待测液，准确振荡30 s，在734 nm处测定吸光度，计算ABTS+清除率[6]。

1.5 羟自由基清除率的测定

1 mL样品加入1 mL FeSO4(12 mmol·L-1)，再加入1 mL H2O2(12 mmol·L-1)，37 ℃下保温10 min，再加入1 mL 6 mmol·L-1水杨酸，37 ℃下保温30 min，然后10 000 r·min-1，4 ℃下离心10 min，取上清液在510 nm处测定吸光度。以70%乙醇溶液代替同样体积的样品作为空白，计算羟自由基清除率[7]。

1.6 还原力测定

取0.4 mL样品，加入1 mL 0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲液，再加入1 mL 1%铁氰化钾溶液，混合液于50 ℃下水浴20 min，加入1 mL 10%三氯乙酸后，4 ℃下1 000g离心10 min，取2 mL上清液，加入0.2 mL 0.1%三氯化铁溶液中，于700 nm处测定吸光度，吸光度值大则表示还原力强[8]。

2 结果与分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

当DPPH自由基与抗氧化剂反应后，会随着还原而逐渐褪色，在517 nm处的吸光度降低。由表1可以看出，3种猴头菇的醇提物随着浓度的增大，DPPH自由基清除能力增强，不同成熟度的子实体提取物的DPPH自由基清除率在未成熟时都表现出最高，5 mg·mL-1时，99号的清除率最高为59.5%，明显优于2号的清除率(48.7%)。黄越等[9]提取猴头的粗多糖对清除DPPH自由基的研究表明，当粗多糖浓度为5 mg·mL-1时，3种多糖A-HeP、U-HeP和W-HeP对DPPH自由基的清除率分别为71.67%、55.12%和47.91%。实验表明，猴头菇中一些小分子物质与多糖等大分子同样具有抗氧化效果。

表1 样品DPPH自由基清除率

2.2 清除ABTS+的能力

含抗氧化成分的样品与ABTS+发生反应而使反应体系褪色。ABTS+的最大吸收波长 734 nm处检测吸光度的变化，可测定样品对ABTS+自由基的清除能力。猴头菇提取物对ABTS自由基的清除作用见表2。1号品种表现出优秀的清除能力，不同成熟度的子实体提取物在2 mg·mL-1时的清除率均超过了95%，99号提取物在3 mg·mL-1的清除率也超过了95%，2号的ABTS+自由基的清除能力略逊于前两者。吴美媛等[10]比较猴头菇的不同溶剂提取物的ABTS+自由基的清除能力，猴头菇热水、乙醇及丙酮提取物2 mg·mL-1对ABTS+自由基的清除率分别为52.06%、63.84%，49.59%。说明不同品种与提取试剂对抗氧化作用有明显的差异。

表2 样品ABTS+清除率

2.3 清除羟自由基的能力

H2O2和Fe2+混合产生羟自由基，在体系内加入水杨酸，可捕捉羟自由基并产生有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收。加入抗氧化物质，会与水杨酸形成竞争，使有色产物的生成量减少，通过吸光度的变化评价羟自由基的清除能力。猴头菇提取物对羟自由基的清除能力见表3。3种猴头菇的醇提物随着浓度的增大清除能力增强，不同品种之间的清除率有较大的差别，99号品种在高浓度时羟自由基清除率在60.9%～70.8%，2号品种的清除率相对最弱，为23.7%～35.8%，但不同成熟度之间的清除能力没有明显的规律。

表3 样品羟自由基清除率

2.4 还原力

还原能力是反映物质抗氧化活性的一个重要指标，还原力与抗氧化活性呈正相关，还原能力越大，抗氧化活性越高。表4表明，猴头菇醇提物浓度为1～5 mg·mL-1时，还原力随着浓度的升高快速增强，呈现明显的剂量依赖性，2号不同成熟度的还原能力都优于1号和99号。何晋浙等[11]在研究不同产地的猴头菇多糖的还原力时，当多糖浓度为5 mg·mL-1，其在700 nm处的吸光度都在0.55以下。Kozarski等[12]对灵芝多糖还原能力进行研究，当浓度为5 mg·mL-1时，其在700 nm处的吸光度的仅为0.23。说明猴头菇醇提物具有良好的还原能力。

表4 样品还原能力

3 小结

本研究以体外药理活性为导向，比较了不同品种猴头菇在不同成熟度时子实体70%乙醇提取物的体外抗氧化能力，以DPPH自由基、ABTS+自由基、羟自由基的清除率和还原力为指标。研究结果表明，不同品种的猴头菇提取物均具有良好的抗氧化能力，但有较大的差别。1号和99号品种对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率优于2号；2号品种的还原能力最强；99号品种的羟基清除能力最高。研究结果为猴头菇保健品开发提供了思路和参考。