草果胚培养技术研究

胡 彦，张 铁，张志信，杨绪旺，胡展育

（1.文山学院 环境与资源学院，云南 文山 663099；2.文山学院 化学与工程学院，云南 文山 663099）

草果（Amomum tsao-ko）是姜科豆蔻属多年生植物，生长在热带、亚热带荫蔽潮湿的阔叶林中，主要分布于中国云南、广西、贵州等地。草果果实是传统的中药材和调味品。草果具有特殊浓郁的辛辣香味，是一种很好的调味香料；此外，具有燥湿温中、截疟祛痰、瘟疫发热、消食化乱之功效；可以治疗寒湿内阻，脘腹胀痛，痞满呕吐，疟疾寒热，瘟疫发热等病症[1]。草果中的挥发油，含有几十种化学成分，其中的桉油精、香叶醇、柠檬醛等化学成分，具有抗真菌、细菌[2-3]，抗癌[4]、清除DPPH自由基的作用[5]，广泛应用于医药和香料工业[6]。云南是我国草果的主要产地，文山州马关县有“中国草果之乡”的称号，但在栽培上缺乏优良品种，草果产量不高。草果繁殖的方法，一是采用播种繁殖[7]，二是分株繁殖[8]，萧洪东等[9]以草果侧芽为外植体进行组织培养的方法已经有报道，但笔者经过试验后发现其污染率极高，而有关草果胚培养未见报道。本研究以草果的胚为外植体进行组织培养，培养草果无菌苗，取草果无菌苗茎段进行不定芽诱导，然后进行生根培养，以期取得最佳培养基配方，建立草果无性快繁体系，为云南省各地区规模化生产草果优良的种苗提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

取充分成熟的草果种子胚作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基制备

按配方配制实验用培养基，分装入培养瓶后经高压湿热（压力0.12 MPa、温度121 ℃）灭菌25 min，备用。

1.2.2 胚培养

选取充分成熟的草果果实，先用洗洁精将草果清洗干净，然后放入超净工作台内，在无菌烧杯中用75%酒精浸泡10 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡15 min后，以无菌水洗3次，然后取出草果种子，放入灭菌后的烧杯中，按上述草果果实的消毒方法，再对草果种子进行消毒。在无菌条件下，用解剖刀剥取草果胚，接种于下列培养基中：（1）MS+1.0 mg·L-12，4-D；（2）MS+1.0 mg·L-1NAA；（3）MS+1.0 mg·L-1IAA。每种培养基配制20瓶，每瓶培养基中接种2～3粒草果胚。先在25 ℃下进行暗培养20 d，当胚萌发产生愈伤组织膨大后，转入光下培养，光照强度1 600～2 100 lx，温度（25±2）℃，湿度控制在65%～75%，光照12 h·d-1。每10 d观察1次草果胚生长情况，光照培养总时间约30 d，胚直接发育形成无菌苗。计算成苗率，成苗率（%）＝草果的苗数／接种的胚数×100。

1.2.3 正交实验设计研究草果不定芽的增殖培养

在查阅前人试验的基础上[9]，采用L9（34）正交实验设计，筛选草果不定芽增殖培养适宜的培养基，试验因素及水平见表1。取以胚为外植体培养的草果无菌苗，在无菌条件下切成带1～2个节间的茎段，插入9种不同的培养基中进行不定芽诱导，每瓶插入1～2个茎段。培养条件为：温度为25 ℃，光照时间15 h，光照强度为2 000 lx；湿度为75%。

表1 正交实验的因素及水平

诱导培养30 d后，观察记录已萌发的外植体（草果茎段）的数量，计算萌发率。萌发率=已萌发的外植体数÷接种的外植体数。增殖培养前及接种培养30 d后，分别记录每一芽丛的芽数，计算增殖芽数。

增殖芽数=培养后芽数-培养前的芽数

1.2.4 验证试验

通过正交实验确定最佳不定芽增值培养基配比，再将最佳试验处理进行3次重复试验，检验该培养基在诱导草果不定芽培养时的可靠性。

1.2.5 生根培养

在超净工作台上切取健壮的经过增殖培养的草果不定芽，分别接种于以下生根培养基中：（1）MS+0.2 mg·L-1IBA；（2）MS+0.2 mg·L-1NAA；（3）MS+0.1 mg·L-1IAA+0.1 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1IBA。观察不同培养基对草果生根率和根生长情况的影响。以上每种生根培养基接种10瓶，每瓶接种1～2 株不定芽。

培养条件为光照强度1 500～2 000 lx，温度（25±2）℃，湿度控制在60%～75%，光照12 h·d-1。培养时间约30 d，每10 d观察1次草果不定芽生根生长情况。计算生根率，生根率（%）＝生根的不定芽数／接种的不定芽数×100。

1.2.6 炼苗移栽

草果不定芽生根培养30 d后，转移到荫棚中炼苗，炼苗时间12 d，炼苗结束后，取出小苗，用清水洗净附着在根系上的培养基，然后栽植在营养杯中（营养土由消毒过的腐叶土和菜园土（3∶1）混合配成），置于荫棚下，按常规育苗技术进行水肥管理。

1.3 数据分析

采用Excel 2007软件统计试验数据，用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 胚培养

由草果种子中取出的胚，分别接种于含有2，4-D、NAA、IAA各1.0 mg·L-1的 MS培养基上，先进行暗培养，然后转入光照条件下培养，50 d后，统计成苗率，其结果如下：1.0 mg 2，4-D对诱导胚成苗效果最好，为76.5%、1.0 mg NAA诱导胚成苗率65.3%、1.0 mg IAA诱导成苗率62.6%。（见图1：1，图1：2）

2.2 正交实验不同激素及浓度对草果不定芽增殖培养的影响

由表2可知，处理5，即在添加2.0 mg·L-16-BA，1.5 mg·L-1NAA 和1.0 mg·L-12，4-D的MS培养基上，草果茎段不定芽萌发率最高，达到了89%；极差分析得出，影响草果不定芽分化的主次因素为A＞C＞B，即 6-BA＞2，4-D＞NAA；草果不定芽诱导的最优方案为A2B2C3，即MS+2.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D（见图1：3）。

表2 正交实验结果

由表3可知，6-BA对草果茎段不定芽萌发率的诱导在0.01水平下显著；NAA，2，4-D对草果茎段不定芽萌发率的诱导在0.05水平下均不显著，这与极差分析方法结果一致。

表3 正交实验方差分析

2.3 验证试验

根据正交实验结果，准确地在MS培养基中添加2.0 mg·L-16-BA ，1.5 mg·L-1NAA 和 1.0 mg·L-12，4-D进行重复实验。其草果茎段不定芽萌发率为90%，芽粗壮，说明该实验结果较稳定，不定芽萌发率高，该培养基为最佳培养基。本实验增殖培养阶段的平均增殖率为2.5，尚需进一步研究以提高增殖率。

2.4 生根培养

采用三种不同的培养基配方诱导草果不定芽生根，处理（3），即在添加 0.1 mg·L-1IAA，0.1 mg·L-1NAA 和 1.0 mg·L-1IBA的MS培养基上，不定芽生根率最高，达到97%，并且芽苗生根较好，根较多且粗，其次为处理（2），即在添加0.2 mg·L-1NAA的MS培养基上，生根率88%，生根率最低的是处理（1），即在添加0.2 mg·L-1IBA的MS培养基上，生根率为82%。（见图1：4）

2.5 炼苗移栽及成活率

炼苗移栽后，试管苗恢复生长较快，植株较均匀整齐，试管苗成活率100%。

图1 草果胚培养无性快繁技术生长过程图片

3 讨论与结论

笔者曾经采用草果的侧芽（笋芽）为外植体，开展草果优良品种组培快繁研究，但由于草果带菌多，采用多种方法均未解决污染问题（真菌及细菌污染），导致实验失败。本研究以草果种子的胚为外植体，分别对其进行胚培养、不定芽增殖培养和生根培养实验，并筛选出了最佳培养基配方。（1）胚培养培养基：MS+1.0 mg·L-12，4-D；（2）不定芽增殖培养基：MS+2.0 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-12，4-D；（3）生根培养基：MS+0.1 mg·L-1IAA+0.1 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1IBA。本实验增殖培养阶段的平均增殖率约为2.5，需进一步研究以提高增殖率。

对于组织培养，外植体的消毒是比较困难的环节，所以外植体的选择非常关键。本实验采用草果种子胚作为外植体，在消毒过程中首先对草果果实消毒，然后对种子的种皮消毒，并未伤害到种子里面的胚，避免了消毒剂对外植体的毒害，接种成活率高。

草果为多年生常绿丛生草本经济植物，其果实既可作为中药材，也可作为调味香料用于菜肴烹饪，一般草果种植3～4年后即可开花结果，可连续结果20年以上。种植草果是山区农民增收的重要经济来源，是脱贫致富的一条重要途径[10]。草果种子胚培养无性快繁技术体系的建立，可为云南省各地区规模化生产草果优良品种种苗提供技术支持。