三七绒根栽培白参菌及皂苷转化初步研究

张玉洁，王祯元，韦继雯，陈中坚，闫倩玲

（1.文山学院 三七研究院，云南 文山 663099；2.文山学院 环境与资源学院，云南 文山 663099；3.文山州食品药品检验研究院，云南 文山 663099）

白参菌（Schizophyllum commune Fr.）别名树花、裂褶菌、白花、八担柴、鸡毛菌子、鸡冠菌等，为伞菌目（Agaricales）裂褶菌科（Schizophyllaceae）裂褶菌属（Schizophyllum）[1]。白参菌子实体秀雅、味道馨香爽口，其作为一种食药兼用菌类，包含5种常量元素和26种微量元素，具有富硒作用[2]。研究显示其细胞壁多糖具有免疫调节和抗炎、抗癌作用[3]。白参菌作为一种木腐菌，较易在腐烂的木头或者草本植株上生长，要求较为湿润和偏弱酸性的生长环境[4]。葡萄糖是白参菌菌丝生长的最适碳源，最适的氮源是蛋白胨，最适碳氮比值为40∶1，在碳氮比不同的培养料中栽培，白参菌菌丝生长速度不同，或生长迟缓或生长受到抑制[4]。野生白参菌的采摘会受季节限制，而且产量较少。至今为止，白参菌人工栽培生物学转化率和产量仍然较低[5]，目前仍属于稀有菌类和食药兼用菌类。

三七是云南大宗产业、文山是三七之乡。三七采挖抖落的土壤中含有大量的绒根，其中也含有一定量的三七皂苷。研究利用三七绒根栽培食用菌既可以清理土壤残留，又可以有效利用中药材的边角废料，生产功能食品。

1 材料和方法

1.1 原材料和试剂

三七绒根筛自三七采挖抖落的土壤并晒干保存。白参菌菌种由实验室分离得到，保存于文山学院三七研究院。麸皮、小麦、石膏粉、木屑、马铃薯、甘蔗渣等从文山市场购买；耐高温栽培袋、盖、塞等由专业订购。三七总皂苷、薄层层析板和分析试剂购自深圳市商祺检测器材有限公司。

1.2 母种扩繁和栽培种制作

利用PDA培养基活化并扩繁母种。利用小麦粒培养基扩繁栽培种[6]。

1.3 配料、装袋、灭菌、栽培、养菌、出菇管理和子实体采集

参考前期研究[7]，采用以甘蔗渣为主料的配方为对照栽培白参菌，以不同比例的三七绒根替代其中的甘蔗渣为实验组。实验组和对照组原料及配方如表1。

表1 培养料及配方/%

各实验组和对照组按照培养料配方和所需原料的总量来备料。三七绒根和甘蔗渣剪碎称重后分别浸泡。将含水量调至60%后备用。

利用17×46×0.15 cm聚丙烯耐高温菌袋。每个菌包装料500 g（湿料），包括4个实验组和1个对照组。每组20个菌包，共100个。

灭菌：121 ℃，2.5 h。

接种：接种需要在无菌环境下进行。用种量为5%。

菌丝培养：白参菌属于中低温型菌类，菌丝生长要求15～26 ℃间，出菇温度控制在16～23 ℃。适宜温度下在接种后20 d左右开始出菇。其最佳种植季节是春栽3～5月，秋栽9～11月，在大棚种植环境下可以完成每年4～6茬，同时还可以完成工厂化控温周年化的生产。

出菇管理和子实体采收参考[7]：开袋出菇，喷水保湿并保持通风良好。待子实体叶片长到将要平展时进行采收。每组采收2潮。

产量统计分析：记录并统计各实验组和对照组白参菌菌丝生长速度（菌丝长满菌袋所需时间）和子实体的平均产量。采用SPSS17.0软件和Microsoft Excel 2003对各组数据进行统计分析。

1.4 子实体中皂苷类成分的跟踪检测

真菌细胞可以选择吸收环境中的小分子物质，进入细胞的小分子有机物有些可以被细胞里的酶进行基团转化或修饰。因此，利用薄层层析方法检测三七皂苷被白参菌菌丝吸收及转化情况。

所检样品分为两组。一组是子实体组，包括未添加三七绒根所培养采收的白参菌子实体和分别添加10%，15%，20%三七毛根所培养的白参菌子实体；另一组为菌糠组，分别为添加了10%，15%，20%三七绒根培养白参菌采收子实体后所剩余的菌糠。

样品处理：将各样品进行干燥、研磨，粉碎备用。

皂苷提取：每样品称量5 g，加水50 mL，超声震荡30 min，离心去残渣。取滤液挥干至10 mL左右，用D-101大孔树脂净化柱过滤（小柱用10 mL水冲洗），弃去水液。用70%甲醇（42.7蒸馏水+57.2甲醇）25 mL洗脱皂苷，收集甲醇溶液，水浴挥至近干，残渣以甲醇溶解定容至5 mL，进行层析检测。

对照：三七总皂苷标准品（含量以三七皂苷R16.9%,人参皂苷Rg128.0%,人参皂苷Rb129.7%,人参皂苷Rd 7.3%）,加甲醇制成1 mL各含5 mg的混合溶液。另取三七粉0.5 g，与供试样品一起处理，抽提皂苷成分作为阳性对照。

利用高效硅胶60预制板（Merck）为层析板，以氯仿∶甲醇∶水（65∶35∶10）为展开剂，供试液与对照液分别点样0.2 µL。展开箱预平衡15 min，上行展开，展距7 cm。喷以硫酸乙醇液（1∶10）染色。

2 结果与分析

2.1 三七绒根栽培白参菌的生物学表现

利用甘蔗渣和少量的三七残根为主料栽培白参菌，菌丝初期生长很快，中后期由于内部供氧不足而生长缓慢，限制了菌丝生长速度，刺孔增氧后菌丝逐步延伸到袋底。统计显示，少量的三七残根不会抑制白参菌菌丝生长，反而会有一定的促进作用并可增加子实体产量。15%以上的三七绒根开始显著抑制菌丝生长，并可降低子实体产量。当三七绒根用量超过20%时，菌包内菌丝生长稀疏、只生长出很少的子实体，表明白参菌细胞对三七残根的耐受能力具有一定的限度。表2和表3分别显示各组菌包菌丝长满菌袋所需的平均时间，菌丝平均日生长速度、袋均产量和生物转化率。

图1 普通培养基栽培的白参菌

图2 三七绒根培养基栽培的白参

表2 不同含量的三七残根对裂褶菌菌丝生长速度的影响

表3 不同配方培养料对裂褶菌产量和生物学效率的影响

2.2 皂苷成分的跟踪检测

将从各级样品中抽提的皂苷类生物碱，利用薄层色谱法进行展层和染色得到如下皂苷色谱图。

左侧层析板由左到右分别为三七总皂苷、菌糠（含绒根10%）、菌糠（含绒根15%）、菌糠（含绒根20%）；右侧层析板从左到右为白参菌子实体（10%残根料培养所得）、三七粉、 三七总皂苷、子实体（15%残根培养所得）、子实体（20%残根培养所得）。三七总皂苷（三七皂苷R16.9%,人参皂苷Rg128.0%,人参皂苷Rb129.7%,人参皂苷Rd 7.3%）

总皂苷标准品自下而上分别为人参皂苷Rb1，Re，三七皂苷R1，人参皂苷Rd。

其中，利用三七粉抽提所得三七皂苷和皂苷标准品主条带基本一致。左侧层析板显示，各实验组菌糠中皂苷成分与标准品相比都有所变化，表现为下面两个条带的减少和展层上面条带的增加。此效果或许因为培养料中三七皂苷在高温高压过程使Rb1，Re分子中的糖配体被降解，或许因为菌丝生长过程中白参菌细胞对皂苷分子进行了生物转化转化。

图3 菌糠与子实体中皂苷含量层析色谱

对子实体中皂苷类物质成分检测的结果显示，有些小分子皂苷被白参菌菌丝成功吸收。说明三七皂苷成分可以被菌丝吸收并被转移到白参菌子实体中。

3 结论与讨论

利用三七残根培养白参菌，子实体中会出现与三七粉和三七皂苷标准对照品中某些对应的三七皂苷植物碱的染色点，说明白参菌菌丝体吸收了培养料中的某些小分子皂苷成分或皂苷的降解产物。

培养料中添加少量的三七根对白参菌菌丝生长具有促进作用，并可提子实体高产量。三七根的用量超过15%会抑制白参菌菌丝体和子实体的生长，说明白参菌对三七绒根的利用有机一定限度。