川牛膝醇提物对野百合碱诱导大鼠肺动脉高压的影响及机制研究▲

马秀涛 黄初生 冯 旭 黄子春 叶 超 黄宏剑 陈平伟 刘慧荣

覃家锦1*

(1 广西医科大学第一附属医院心胸外科，南宁市 530021；2 广西医科大学第二附属医院心胸外科，南宁市 530000)

肺动脉高压是由不同病因引起的肺血管病理生理改变，以肺动脉压力和肺血管阻力进行性升高为主要特征，最终导致右心衰竭的肺循环疾病，其病理变化包括肺血管收缩与重构、肺血管平滑肌和内皮细胞的异常增殖、原位血栓形成等[1]。肺动脉高压预后较差，死亡率较高，3年生存率<54.9%[2]。肺动脉高压目前尚无特效治疗方法，其确切机制尚未阐明。川牛膝醇提物主要以川牛膝为原料，经过乙醇提取，大孔树脂分离纯化，硅胶柱色谱分离、结晶、干燥得到的生物碱，主要成分为牛膝甾酮等[3]。本研究通过野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压模型，探讨川牛膝醇提物对大鼠血流动力学、肺血管的影响及机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 川牛膝醇提物由广西医科大学第一附属医院提供；成年雄性SD大鼠40只，体重(220±20)g，10周龄，由广西医科大学实验动物中心提供；MCT为美国Sigma公司产品；10%的水合氯醛购置于广西医科大学第一附属医院(批号：1501004-WS10)；光学显微镜为日本Olypus电子公司产品；Powerlab多通道生理记录仪为上海然哲仪器设备有限公司产品。

1.2 方法 将40只SD大鼠随机均分为对照组、MCT组、高剂量组(川牛膝醇提物24 g/kg)、中剂量组(川牛膝醇提物12 g/kg)和低剂量组(川牛膝醇提物6 g/kg)。后4组大鼠均一次性腹腔注射MCT 60 mg/kg建立肺动脉高压模型，对照组注射等量生理盐水。MCT注射第28天，高、中、低剂量组分别给予相应剂量的川牛膝醇提物灌胃，各1次/d，连续2周，对照组和MCT组分别予以等量的生理盐水灌胃。

1.3 测量指标

1.3.1 mPAP、RVSP和右心室肥厚指数 实验进行6周后，给予大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰卧固定在操作台上，游离右颈外静脉，采用右心导管法[4]，将聚乙烯导管经右颈外静脉插入大鼠肺动脉，导管另一端接压力换能器及多通道生理记录仪，测定平均肺动脉压(mPAP)及右心室收缩压(RVSP)。测定完血流动力学指标后处死大鼠，取出双肺和心脏，去除左右心房和大血管，并沿着室间隔边缘剪下右心室、左心室及室间隔。去除血液和水分后，利用精密电子天平测量右心室、左心室和室间隔质量。右心室肥厚指数=右心室质量/[左心室质量+室间隔质量]。

1.3.2 肺小动脉中膜厚度 留取右肺上叶于液氮中保存，应用4%多聚甲醛固定，脱水后常规石蜡包埋切片并进行苏木素-伊红(HE)染色，观察肺小动脉的形态学变化。每个样本随机选择直径25～100 μm的肺小动脉5～10根，在光学显微镜下分别测定血管壁内镜和外径，其差值为血管壁厚度(WT)，血管壁厚度百分比(%)=(血管外径-血管内径)÷血管外径×100%。

1.3.3 血清MDA含量和SOD活性的检测 采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)检测MDA的含量，参照试剂盒说明书操作步骤及计算公式进行操作和计算。采用黄嘌呤氧化酶(XOD)法检测SOD活性，参照试剂盒说明书操作步骤及计算公式进行操作和计算。

1.3.4 PI3K、Akt mRNA水平检测 取50～100 mg肺组织置入1.5 mL EP管中，采取Trizol一步法提取RNA。在0.5 mL微量离心管中，加入总RNA 5 μg，补充适量的焦碳酸二乙酯(DEPC)水使总体积达12 μL。在管中加10 μmol/lT重复寡核苷酸(OligodT)引物溶液至15 μL，混匀、离心；70 ℃加热10 min，立即插入冰浴中，离心，冰上加入10×PCR缓冲液2 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、10 mmol/L dNTPmix 1 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL，混匀、离心。42 ℃孵育2～5 min。加入逆转录酶Ⅱ1 μL，42 ℃水浴中孵育50 min。于70 ℃加热15 min以终止反应。将管插入冰中，加入核糖核酸酶H 1 μL，37 ℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20 ℃保存备用。PCR扩增。取0.5 mL PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μL；上游引物(10 pmol/L) 2 μL；下游引物(10 pmol/L)2μL；dNTP(2 mM)4 μL；10×PCR缓冲液5 μL；Taq酶(2 u/μL)1 μL。加入适量的双蒸水(dd H2O)，使总体积达50 μL。轻轻混匀，离心。扩增条件：94 ℃变性30 s；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸24 s，40 个循环。行琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下观察结果。采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

1.3.5 PI3K、Akt蛋白水平的检测 取冻存的肺组织50 mg裂解后提取总蛋白。采用Westem blot检测PI3K/Akt的表达：蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体；对固定于硝酸纤维素滤膜上的蛋白质进行染色；封闭硝酸纤维滤膜的免疫球蛋白结合位点。

2 结 果

2.1 mPAP、RVSP、右心室肥厚指数及WT百分比比较 与对照组比较，MCT组、低剂量组各指标显著增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与MCT组比较，高、中剂量组各指标明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。高、中剂量组与对照组比较，各指标间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组mPAP、RVSP、右心室肥厚指数及WT百分比比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与MCT组比较，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05

2.2 血清MDA和SOD活性比较 与对照组比较，高、中、低剂量组SOD活性明显高于对照组，MDA含量明显低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2(MCT组未测)。

2.3 PI3K、Akt蛋白及其mRNA的表达 与对照组比较，MCT组、低剂量组PI3K、Akt蛋白及其mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。与MCT组比较，高、中剂量组PI3K、Akt蛋白及其mRNA的表达水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，高、中剂量组PI3K、Akt蛋白及其mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 各组血清SOD和MDA的比较

注：与对照组比较，*P<0.05

表3 各组PI3K、Akt蛋白及其mRNA的表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与MCT组比较，#P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05

3 讨 论

肺动脉高压是以肺动脉系统循环阻力进行性增加为特征的一组疾病，其病理变化包括肺血管收缩与重构、肺血管平滑肌和内皮细胞的异常增殖、原位血栓的形成等[5-6]，如果不予以治疗，会导致右心衰竭，容量负荷增加直至死亡。川牛膝有一定的降压作用，刘彦灸等[7]发现川牛膝提取物能降低自发性高压大鼠血压，其机制可能为其可降低 TGF-β1 对肾小球细胞的刺激，从而减少肾素释放，降低血管紧张素Ⅱ生成，进而加剧血管扩张，降低血压。

本实验采用单次经腹腔注射野百合碱成功建立肺动脉高压大鼠模型，实验结果显示，MCT组大鼠肺动脉高压、右心室收缩压、右心室肥厚指数明显高于对照 组，差异具有统计学意义(P<0.05)。本研究中，高、中剂量组可以明显降低肺动脉压力、右心室收缩压，与MCT组相比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，证实了川牛膝醇提物具有降低野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉压力的作用。在组织层面上，实验结果显示，高、中剂量组肺小血管狭窄程度、肺小血管中膜厚度较MCT组有明显改善，差异具有统计学意义(P<0.05)。川牛膝醇提物可下调肺动脉高压大鼠PI3K、Akt蛋白及其mRNA表达水平，以高、中剂量组下调最明显。川牛膝醇提物可以提高大鼠血清超氧化物歧化酶活性，降低大鼠血清丙二醛含量。

肺动脉高压病因机制十分复杂，目前研究发现包括氧化应激、血管活性物质失衡、内皮功能障碍、遗传倾向、原位血栓形成和炎症等[8]。虽然肺动脉高压的形成机制还没有完全阐明，但是国内外大量研究证实了氧化应激在肺动脉高压的病理生理中起到至关重要的作用[9-11]。肺动脉高压中出现的氧化应激包括蛋白质氧化、脂质过氧化、抗氧化物质含量降低、DNA过氧化和酶类变性[12]。研究发现，活性氧可以作为第二信使，活化信号转导通路，从而导致细胞功能和结构破坏、组织损伤和器官病变，甚至导致癌变，也参与调节细胞生长途径、细胞增殖、抑制细胞凋亡、改变转录因子[11]。丙二醛是脂质过氧化中的一类终末代谢产物，MDA的含量可以反映出机体内脂质过氧化反应的程度。超氧化物歧化酶是清除体内活性氧簇(ROS)的关键酶，也属于人类机体内天然的抗氧化酶，可以清除体内自由基、参与维持机体内自由基的平衡，从而保护机体组织细胞。活性氧物质及其信号转导系统参与肺动脉血管内皮细胞重构，其中涉及内皮细胞的损伤和凋亡以及肺动脉血管平滑肌细胞的增殖[13-14]。张志英等[15]研究证实牛膝抗氧化作用非常明显。本研究发现川牛膝醇提物可以提高肺动脉高压大鼠血清超氧化物歧化酶活性，降低肺动脉高压大鼠血清丙二醛含量。川牛膝醇提物具有非常强的抗氧化作用，能够保护肺小血管内皮功能，阻止脂质过氧化导致的炎症反应，从而阻止肺动脉高压的发生。

PI3K/Akt/mTOR信号通路是恶性肿瘤细胞Warburg效应中最重要的调节通路之一[16-17]，Warburg效应的机制为PI3K磷酸化活化Akt，活化后的Akt可以通过mTOR上调HIF1a的表达，后者通过上调糖代谢中关键的调节酶3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)表达，从而抑制丙酮酸脱氢酶(PDH)的活性，导致在有氧环境下的葡萄糖代谢转向糖酵解途径[18]。PI3K和其相关的信号转导通路在血管平滑肌细胞的增殖和迁移中发挥着至关重要的作用，机制是通过上调细胞周期蛋白D1(CyclinD1)从而促使血管平滑肌细胞的增殖和迁移。

综上所述，本研究发现川牛膝醇提物能够降低野百合碱诱导的大鼠肺动脉压力，降低肺血管重构，其作用机制可能与下调肺组织PI3K/Akt信号通路有关。