电子束辐照对鲈鱼肉肌原纤维蛋白生化特性及其构象的影响

张 晗，高 星，宣仕芬，徐大伦，张进杰，钱云霞，杨文鸽*

（宁波大学食品与药学学院，浙江省动物蛋白食品精深加工重点实验室，浙江 宁波 315211 ）

鲈鱼（Lateolabrax japonicus）是我国重要的海水养殖鱼类之一，2016年全国海水鲈鱼养殖产量达12.25万 t[1]，鲈鱼肉因其高蛋白低脂肪及鲜美的滋味而备受人们喜爱，然而新鲜鲈鱼肉容易腐败，因此，延长其货架期十分必要。电子束辐照作为新型的冷杀菌方式，常用于农畜产品及水产品的杀菌保鲜。杨文鸽等[2]采用电子束辐照处理鲜牡蛎，发现1～5 kGy辐照抑菌效果明显，可延长货架期4～8 d；Alahakoon等[3]研究电子束辐照结合柑橘提取物对鸡胸肉的影响，结果表明辐照后鸡胸肉的菌落总数明显减少。近年来电子束辐照在鲈鱼保鲜方面的应用亦逐渐开展，如鉏晓艳等[4]发现鲈鱼肉经低于4.41 kGy的电子束辐照，能最大限度保持其感官品质和质构特性；本实验室亦采用电子束辐照处理鲈鱼肉，发现冷藏前经3～5 kGy辐照，能降低1～2 个数量级的菌落总数，延长鲈鱼肉货架期6～10 d[5]。

然而，辐照在杀灭微生物、延长食品保质期的同时，也能作用于蛋白等生物大分子而引起肌肉蛋白质化学作用力、生化特性的改变，导致蛋白变性或凝胶化。Shi Yan等[6]采用γ射线辐照处理鱼肉，发现随着辐照剂量的增加，肌球蛋白重链含量逐渐减少，当辐照剂量达到8 kGy时，肌球蛋白重链彻底消失，并推测与辐照引起蛋白质的交联有关；陈茜茜等[7]发现辐照后牛肉蛋白的羰基含量明显增加，认为辐照促进了蛋白质的氧化；Cieśla等[8]研究表明辐照后牛奶蛋白在酰胺I带的吸收峰有明显的红移现象。肌原纤维蛋白作为鱼肉蛋白重要的组成部分，其生化特性及其结构的变化与蛋白的功能特性、鱼肉品质密切相关。因此，采用辐照保鲜鱼肉的同时，关注辐照剂量对肌原纤维蛋白生化特性及其结构的影响亦十分重要。本实验以新鲜海鲈鱼（Lateolabrax japonicus）肉为原料，通过不同剂量电子束辐照处理，分析辐照对鱼肉肌原纤维蛋白盐溶蛋白含量、巯基含量、二硫键含量、Ca2+-ATPase活力、表面疏水性以及蛋白羰基含量的影响，并结合圆二色光谱分析蛋白二级结构，在分子水平探讨辐照对肌原纤维蛋白生化特性的影响机理，为辐照技术在水产品保鲜中的应用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活海鲈鱼（Lateolabrax japonicu）购于宁波路林水产市场，共50 条，每条体质量约500 g，体长约35 cm。活鱼宰杀后去除头、尾、内脏，清洗干净后沿脊柱分为两半。鲈鱼肉每包300 g，真空包装备用。

Tris-马来酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic a c i d，E D TA）、5,5’-二硫代2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DNTB） 国药集团化学试剂有限公司；2,4-二硝基苯肼、盐酸胍 上海阿拉丁试剂公司。

1.2 仪器与设备

Biofuge Stratos型台式高速冷冻离心机 德国Thermo Scientific Sorval公司；BP221S电子分析天平德国Sartorius公司；SpectraMax i3多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；J-1500型圆二色光谱仪 Jasco日本分光株式会社；NBL-1010型电子直线加速器宁波超能科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼肉的电子束辐照处理

采用NBL-1010型电子直线加速器（能量10 MeV、剂量率1 kGy/s）对鲈鱼肉进行辐照处理，剂量分别为0、1、3、5、7 kGy，其中0 kGy为对照组。为保证辐照均匀性，鱼肉单包排列。各剂量设置3 组平行，辐照后立即取样检测各项指标。

1.3.2 肌原纤维蛋白的提取与含量测定

参考林娴萍等[9]的方法稍作修改。取2 g鲈鱼肉，加入10 倍体积缓冲液A（20 mmol/L pH 7.0 Tris-马来酸、0.05 mol/L KCl），匀浆，10 000 r/min离心15 min，沉淀用缓冲液A洗涤2 次。沉淀加入15 倍体积缓冲液B（20 mmol/L pH 7.0 Tris-马来酸、0.6 mol/L KCl），匀浆后浸提60 min，10 000 r/min离心15 min，上清液即为肌原纤维蛋白溶液，采用双缩脲法测定蛋白含量。

1.3.3 总巯基和活性巯基含量的测定

根据Benjakul等[10]的方法稍作修改。取1 mL肌原纤维蛋白溶液，加9 mL Tris-HCl（含8 mol/L尿素、质量分数2%十二烷基硫酸钠、10 mol/L EDTA，pH 6.8），混匀后取4 mL加0.4 mL 0.1% DNTB溶液（DNTB溶于0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），40 ℃水浴25 min，于412 nm波长处测吸光度。用0.6 mol/L KCl替代样品，作为空白。活性巯基含量测定时，采用不含尿素的Tris-HCl，其余操作均同上。以摩尔吸光系数13 600 L/（mol·cm）计算巯基含量。

1.3.4 二硫键含量的测定

根据Thannhauser等[11]的方法测定二硫键含量。

1.3.5 表面疏水性的测定

现代企业制度的建立是基于设备管理基础上的，设备全过程的管理包括了人员组织、技术应用以及经济总体功能等内容，实现了无形价值理念与具体设备实物管理的结合，让企业对设备的高效实用与管理奠定了基础。

根据Chelh等[12]的方法稍作修改，以溴酚蓝结合量表征肌原纤维蛋白的表面疏水性，两者呈正相关。用磷酸盐缓冲液（20 mmol/L，pH 6.0）将肌原纤维蛋白稀释至2 mg/mL。取1 mL肌原纤维蛋白溶液，加入1 mg/mL的溴酚蓝溶液200 μL，混合均匀，25 ℃下反应10 min，3 000 r/min离心15 min，将上清液稀释10 倍，于595 nm波长处测吸光度。以磷酸盐缓冲液作为空白。溴酚蓝结合量按下式计算。

式中：A0为空白吸光度；A为样品吸光度。

1.3.6 Ca2+-ATPase活力的测定

采用Thanonkaew等[13]的方法测定，结果以每分钟生成1 µmol磷所需的酶量为一个活力单位，单位为μmol/（mg·min）。

1.3.7 蛋白羰基含量的测定

参照Oliver等[14]的方法，并稍作修改。取1 mL肌原纤维蛋白溶液，加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼，室温下在暗处静置1 h，加入1 mL体积分数20%三氯乙酸，10 000 r/min离心10 min，沉淀用1 mL乙酸乙酯-乙醇（1∶1，V/V）清洗3 次，加3 mL 6 mol/L盐酸胍溶液，37 ℃水浴15 min，10 000 r/min离心5 min，于370 nm波长处测吸光度。以摩尔吸光系数2 200 L/（mol·cm）计算蛋白羰基含量。

1.3.8 圆二色光谱测定

参照杨玉玲等[15]的方法略作修改。提取的肌原纤维蛋白用缓冲液B稀释至0.2 mg/mL进行圆二色光谱检测。扫描光谱范围190～240 nm，比色皿直径1 mm，测定温度25 ℃，扫描速率50 nm/min，响应时间0.25 s，光谱重复扫描3 次，累加得到圆二色光谱图。以缓冲液B为空白，利用仪器自带软件分析肌原纤维蛋白二级结构单元的含量。

1.4 数据处理与分析

实验设3 个平行，数据用平均值±标准差表示，分别采用SAS 9.1.3和Origin 9软件进行统计分析和作图。其中P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 电子束辐照剂量对鲈鱼肉肌原纤维蛋白盐溶性的影响

图1 辐照剂量对鱼肉盐溶蛋白含量的影响Fig. 1 Effect of irradiation dose on salt-soluble protein content of fi sh meat

蛋白溶解性常用于表示蛋白质交联和聚集的程度，在一定程度上可表征蛋白的氧化程度。由图1可知，当辐照剂量为3 kGy及以下时，肌原纤维蛋白盐溶性无显著变化（P＞0.05），当辐照剂量继续上升时，盐溶蛋白含量显著下降（P＜0.05）。鱼肉蛋白的功能特性主要取决于肌原纤维蛋白，蛋白质的变性会使其溶解性下降，从而使盐溶蛋白含量减少[16]。高剂量辐照使盐溶蛋白含量减少，原因可能是由于辐照能使肌原纤维蛋白发生氧化变性[17-18]，且辐照剂量越高，这种氧化现象越明显，导致蛋白盐溶性显著降低。

2.2 电子束辐照剂量对鲈鱼肉肌原纤维蛋白巯基及二硫键含量的影响

由图2可知，随着辐照剂量的增加，总巯基含量呈先上升后下降的趋势。与对照组相比，1 kGy与3 kGy辐照组肌原纤维蛋白的总巯基含量显著增加，活性巯基含量无显著差异（P＞0.05），而当辐照剂量为5 kGy和7 kGy时，总巯基和活性巯基含量均开始下降，并且显著低于1、3 kGy辐照组和对照组（P＜0.05）。相较于对照组，1 kGy辐照后肌原纤维蛋白中二硫键含量略有上升，但并不明显（P＞0.05），随着辐照剂量的增加，二硫键含量亦呈现继续上升的趋势。两个巯基被氧化形成的共价键即为二硫键，从图2可以看出，巯基含量的下降伴随着二硫键含量的上升，说明一定剂量的辐照会加速蛋白质氧化变性。辐照能暴露部分包埋于蛋白分子内部的巯基，低剂量组巯基含量的上升可能是由于分子内部巯基的暴露，然而电子束辐照又会促进鱼肉中的水等小分子物质发生电离，产生羟自由基等促进巯基的氧化，高剂量组巯基含量的显著下降伴随着二硫键含量的显著上升，这与羟基自由基的产生、暴露出的巯基更容易被氧化有关[19-21]。Jaczynski等[22]研究辐照对狭鳕鱼鱼糜凝胶肌原纤维蛋白巯基含量的影响，结果表明总巯基和活性巯基含量在0～6 kGy均随辐照剂量的增大而增加，当辐照剂量大于6 kGy时逐渐减小，这与本实验结果类似；王宁等[23]在研究辐照对牛肉蛋白影响时亦得到类似结果。结合图1、2，盐溶蛋白和巯基含量的下降均出现在辐照剂量大于3 kGy，认为肌原纤维蛋白盐溶性的下降与其巯基被氧化密切相关。

图2 辐照剂量对肌原纤维蛋白巯基及二硫键含量的影响Fig. 2 Effect of irradiation dose on sulfhydryl and disulfide bond content of myofibrillar protein

2.3 电子束辐照剂量对鲈鱼肉肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力的影响

图3 辐照剂量对肌原纤维蛋白Ca2-ATPase活力的影响Fig. 3 Effect of irradiation dose on Ca2+-ATPase activity of myofibrillar protein

Ca2+-ATPase活力是评价肌动球蛋白完整性的良好指标，蛋白质的变性会引起其酶活力的改变。如图3所示，1 kGy辐照组肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力为0.0 2 6 2 μ m o l/（ m g· m i n） ， 与 对 照 组0.026 1 μmol/（mg·min）无显著差异（P＞0.05）。当辐照剂量上升至3 kGy时，Ca2+-ATPase活力显著下降至0.022 9 μmol/（mg·min）（P＜0.05）。随着辐照剂量的继续上升，Ca2+-ATPase活力继续下降，7 kGy辐照组仅为0.021 0 μmol/（mg·min）。Ca2+-ATPase的活性中心位于肌球蛋白头部[24]，Ca2+-ATPase活力的下降可能是辐照使肌球蛋白的球状头部构型发生改变引起的。此外，有学者认为，由于巯基氧化产生二硫键使分子聚合，也会导致ATPase活力的下降。本研究中，Ca2+-ATPase活力的下降与Li Yanqing等[25]的发现相似，高剂量的辐照破坏了肌动球蛋白的完整性，使肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力发生不同程度的下降。

2.4 电子束辐照剂量对鲈鱼肉肌原纤维蛋白表面疏水性的影响

图4 辐照剂量对肌原纤维蛋白表面疏水性的影响Fig. 4 Effect of irradiation dose on surface hydrophobicity of myofibrillar protein

当蛋白构象发生变化，包埋于分子内部的一些疏水性氨基酸残基会暴露于分子表面，导致蛋白质的表面疏水性发生变化。如图4所示，电子束辐照后，鲈鱼肉肌原纤维蛋白的表面疏水性呈现先上升后下降的趋势，并于5 kGy时达到最大值。表面疏水性的上升是由于肌原纤维蛋白受到辐照后发生氧化，一些疏水性氨基酸残基暴露于蛋白分子表面。此外，辐照所产生的自由基通过攻击氨基酸侧链而影响肌原纤维蛋白的表面疏水性，当辐照剂量高至7 kGy时，表面疏水性显著下降（P＜0.05），原因在于高剂量的辐照使蛋白质发生交联，暴露在表面的疏水基团又被重新包埋，引起表面疏水性下降[26]。An等[27]采用辐照处理过氧化物酶蛋白，其表面疏水性也呈现出先增大后减小的趋势，且在5 kGy时达到最大值。

2.5 电子束辐照剂量对鲈鱼肉肌原纤维蛋白羰基含量的影响

图5 辐照剂量对肌原纤维蛋白羰基含量的影响Fig. 5 Effect of irradiation dose on carbonyl content of myofibrillar protein

羰基含量是衡量肌肉蛋白氧化的重要指标之一，羰基的形成途径有两种：通过多肽主链的断裂[28]和氨基酸侧链的直接氧化[29]，或通过美拉德反应以及非蛋白羰基化合物的共价结合[30]形成。辐照后，鲈鱼肉肌原纤维蛋白羰基含量的变化如图5所示。与对照组相比，除1 kGy辐照组羰基含量无显著性变化外（P＞0.05），3、5、7 kGy辐照样品肌原纤维蛋白羰基含量均显著上升（P＜0.05），这一结果与电子束辐照对鲈鱼肉脂质氧化指标硫代巴比妥酸值的影响[5]一致。通过辐照产生的自由基攻击蛋白肽链，使氨基酸侧链—NH或—NH2发生修饰而转化为羰基，且辐照剂量越高，辐解产生的自由基也越多[31]，肌原纤维蛋白更易受到攻击而发生氧化。Riebroy等[32]采用0、2、6 kGy γ辐照处理鲷鱼蛋白也得到了类似的结果，辐照鲷鱼蛋白羰基含量明显高于对照组，且剂量越大，羰基含量越高。

2.6 电子束辐照剂量对鲈鱼肉肌原纤维蛋白二级结构的影响

图6 肌原纤维蛋白的圆二色光谱图Fig. 6 CD spectrum of myofibrillar protein

图7 辐照剂量对肌原纤维蛋白二级结构含量的影响Fig. 7 Effect of irradiation dose on secondary structure contents of myofibrillar protein

圆二色光谱借助于光学活性物质在左右旋偏振光照射下表现出的偏振光之差分析分子内部的结构信息，是研究蛋白质二级结构的一个重要工具。蛋白质的圆二色性主要来源于酰胺键的相互作用，因此常于190～250 nm波长范围内测量其圆二色光谱[33-34]。图6为辐照前后鲈鱼肉肌原纤维蛋白圆二色光谱图，经分析得到的二级结构含量如图7所示。在天然状态下，蛋白质以特定形状的折叠态类球状分子存在，当发生变性时，其折叠状态会逐渐打开。辐照所产生的自由基可能会对蛋白肽链以及氨基酸侧链进行攻击，从而影响蛋白质的空间构象。从图7可以看出，辐照后鲈鱼肉肌原纤维蛋白中α-螺旋含量的下降伴随着β-折叠含量的增加，而β-转角及无规卷曲含量无显著变化（P＞0.05）。与对照组相比，1 kGy辐照组肌原纤维蛋白的α-螺旋和β-折叠含量仅有微小变化，表明1 kGy辐照对肌原纤维蛋白构象无明显的改变，这与1 kGy辐照组肌原纤维蛋白除总巯基含量外其他生化指标均无显著变化相一致。随着辐照剂量继续上升，肌原纤维蛋白的α-螺旋含量下降，β-折叠含量增加，说明高剂量辐照会促进肌原纤维蛋白中的α-螺旋向β-折叠结构转化，相比于紧密的α-螺旋构象，β-折叠结构的肽链在空间的排列更加伸展，使位于分子内部的—SH等活性基团和疏水基团暴露出来，蛋白质分子发生变性，从而影响了肌原纤维蛋白的生化特性，且高剂量的辐照对蛋白特性的影响更大。肌原纤维蛋白生化特性的改变对鱼肉的质构特性会带来一定影响，随着辐照剂量的增加，鱼肉的硬度略微上升，弹性、咀嚼性和回复性则有所下降，其中咀嚼性在辐照剂量达到3 kGy及以上时显著下降[5]。

3 结 论

电子束辐照对鲈鱼肉进行保鲜的同时，亦会引起鱼肉肌原纤维蛋白的氧化变性。电子束辐照后，鲈鱼肉肌原纤维蛋白二级结构发生改变，随着辐照剂量的上升，

α-螺旋含量减少，β-折叠含量逐渐增加，肌原纤维蛋白肽链在空间的排列更加舒展，暴露了部分包埋在分子内部的活性基团和疏水基团，从而影响了肌原纤维蛋白的生化特性。与对照组相比，1 kGy辐照组鲈鱼肉肌原纤维蛋白除总巯基含量外各指标无显著性变化，3 kGy辐照组肌原纤维蛋白盐溶性和巯基含量与1 kGy组无显著差异，而5 kGy和7 kGy辐照组鱼肉蛋白盐溶性、巯基含量、二硫键含量、表面疏水性、蛋白羰基含量以及Ca2+-ATPase活力均发生显著变化。辐解产生的自由基能加速肌原纤维蛋白的氧化变性，而这些变化都将影响肌原纤维蛋白的功能及鲈鱼肉的品质。因此，利用电子束辐照保鲜鱼肉，应结合保鲜效果选择较低剂量进行辐照处理。