血清miR-133a 、miR-150在心房颤动患者中的表达水平及临床意义

孙杰，佟子川，郭丽敏，唐学弘

心房颤动（AF，房颤），是临床中常见的 心律失常。房颤发生时，心房收缩和舒张能力异常，导致心脏泵血功能受损，血流瘀滞，易形成血栓栓塞、心力衰竭等并发症，严重威胁患者健康[1,2]。由于我国人口老龄化的加剧，房颤患者人数不断上升。目前，房颤的疗效并不理想，预防和治疗房颤一直是心血管疾病研究的热点。microRNAs（miRNAs）是一类高度保守的非编码小分子RNA，在转录后水平调控基因表达，参与细胞生长、分化、凋亡等生物学过程。多种miRNA通过参与心肌电重构和结构重构在房颤的发生、发展过程中起重要作用。Soeki等[3]研究发现房产患者血清miR-328水平升高，其与与左心房电压区指数呈正相关，左心房局部产生miR-328可能参与房颤患者的心房重构过程。李菲等[4]研究发现，房颤患者血清miR-101表达下调，其可能通过上调L型钙通道β2和钠钙交换体（NCX）诱发或促进房颤发生。研究发现，miR-133a在心肌中特异性表达，参与调节心肌细胞分化、增殖[5]。miR-150表达与心肌重构、心肌纤维化等密切相关[6]。本研究通过qRT-PCR技术检测房颤患者血清miR-133a和miR-150表达水平，分析其临床意义，为房颤的临床诊断标记物的选择和该疾病的治疗寻找新的突破口。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2015年1月至2016年12月于首都医科大学大兴教学医院心内科住院治疗的73例房颤患者为研究对象，其中男性41例，女性32例，年龄39～86岁，平均年龄（59.43±8.71）。依据2014年《美国心房颤动治疗指南》将73例房颤患者分为阵发性房颤21例、持续性房颤28例、永久性房颤24例。排除标准：①合并恶性肿瘤患者；②合并自身免疫疾病患者；③合并肾功能不全患者；④临床资料完整者。另选取25例健康志愿者为对照组，其中男性14例，女性11例，年龄35～85岁，平均年龄（58.27±8.69）岁。所有受试者均自愿签署知情同意书。

1.2 实验试剂和仪器RNA提取试剂盒，美国Invitrogen公司；荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，日本Takara公司；引物由金斯瑞生物科技公司设计提供。AU5800全自动生化分析仪，贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；Nano-400超微量核酸仪，杭州奥盛仪器有限公司；LightCycler®96实时荧光定量PCR仪，罗氏诊断产品（上海）有限公司。

1.3 血样采集采集所有受试者清晨空腹静脉血，置于抗凝管中，4℃、3500 r/min离心10 min，收集上清液-20℃保存备用。经心脏彩超检查获取受试者左心房内径（LAD）和左室射血分数（LVEF）。

1.4 实验室指标检测运用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇 （HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。试剂盒检测基质金属蛋白酶-9（MMP-9）。

1.5 qRT-PCR技术检测血清miR-133a和miR-150水平采用试剂盒提取血清中总RNA，微量核酸仪检测RNA浓度和纯度。在260nm和280nm处吸光值的比值大于1.8时可用于扩增。参照逆转录试剂盒操作说明，将RNA逆转为cDNA，以cDNA为模板进行扩增。内参U6上游引物5'-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGC-3'，下游引物5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGTCT-3'；miR-133a上游引物5'-CAAGCTGGTAAAAATGGA

A-3'；下游引物5'-TATGGTTTTGACGACTGT GTAT-3'。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s，总共进行45个循环，72℃延伸10 min。以U6作为内参，采用2-△△Ct法计算miR-133a和miR-150的相对表达水平。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析。计量资料以（x±s）表示，两组间均数的比较采用t检验。计数资料用n（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较对照组和房颤患者在年龄、性别、吸烟史、饮酒史、TC、TG、HDL-C、收缩压、舒张压比较无显著差异（P＞0.05）。与对照组比，房颤患者LDL-C、hs-CRP、左心房内径和MMP-9水平显著升高（P＜0.05），LVEF水平显著降低（P＜0.05）。不同类型房颤患者之间比较，LDL-C、hs-CRP、LAD、LVEF、MMP-9差异也显著（P＜0.05）（表1～2）。

2.2 对照组和房颤患者血清miR-133a和miR-150比较与对照组比，房颤患者血清miR-133a水平显著升高（P＜0.05），miR-150水平显著降低（P＜0.05）（表3）。

表1 对照组和房颤患者一般资料比较

表2 不同类型房颤患者一般资料比较

2.3 不同类型房颤患者血清miR-133a和miR-150比较阵发性房颤、持续性房颤和永久性房颤三组miR-133a水平依次升高，miR-150水平依次降低。三组间miR-133a和miR-150两两比较，差异均显著（P＜0.05）（表4）。

2.4 房颤患者血清miR-133a和miR-150与各检测指标相关性Pearson相关性分析结果显示，房颤患者血清miR-133a与hs-CRP、左心房内径、MMP-9呈正相关（P＜0.05），与LVEF呈负相关（P＜0.05）；miR-150与hs-CRP、左心房内径、MMP-9呈负相关（P＜0.05），与LVEF呈正相关（P＜0.05）（表5）。

2.5 miR-133a和miR-150诊断价值miR-133a、miR-150单独诊断以及二者联合诊断灵敏度分别为78.1%、83.6%、90.4%，特异度分别为68.0%、68.0%、84.0%、，ROC曲线下面积（AUC）分别为0.693、0.705、0.812。与miR-133a、miR-150单独诊断相比，二者联合诊断的灵敏度、特异度以及AUC均显著提高（P＜0.05），结果如图1所示。

表3 对照组和房颤患者血清miR-133a和miR-150表达水平比较

表4 不同类型房颤患者血清miR-133a和miR-150比较

表5 房颤患者血清miR-133a和miR-150与各检测指标相关性

图1 miR-133a、miR-150以及二者联合诊断的ROC曲线

2.6 logistic回归分析Logistic回归分析结果显示，与hs-CRP、左心房内径、LVEF和MMP-9类似，miR-133a和miR-150也是影响房颤的因素（P＜0.05），结果如表6所示。

表6 logistic回归分析

3 讨论

房颤是一种多因素诱导、多机制参与的心律失常。随着人口老龄化加剧，房颤的发病率不断增加，80岁以上人群患病率超过8%[7]。房颤患者存在心力衰竭、脑卒中等严重的心血管疾病并发症，一直以来都是研究的重点。目前，在心律失常尤其是房颤的诊断方面，缺少有效的诊断指标来预测或诊断其发生情况。本研究通过qRT-PCR技术检测房颤患者血清miR-133a和miR-150表达水平并分析其临床意义，以期为房颤的临床诊断探寻新的方法或分子标记物。

随着对miRNAs研究的的深入，发现miRNAs参与心力衰竭、心律失常、冠心病等心血管疾病的发生、发展，可通过调控不同靶基因在房颤的发生、发展中发挥重要作用[8]。miR-133a是肌肉特异性miRNA，在心肌中特异性表达，参与调节心肌细胞增殖和分化，可以通过抑制心肌缝隙连接蛋白和离子通道蛋白的表达参与心律失常的发生。徐振宇等[9]研究发现慢性心力衰竭（CHF）患者血清miR-133a表达水平显著升高，其表达水平与LVEF呈负相关，与左心房内径呈正相关，检测CHF患者血清miR-133a变化有助于判断患者心室重构情况。miR-150定位于人19号染色体，主要表达于心肌组织、淋巴结和脾脏等组织或器官。研究发现，miR-150参与组织纤维化的发生、发展。心肌纤维化能够造成心机结构重构，进而导致房颤的发生。周小翠等[10]研究发现，心肌梗死边缘区miR-150表达水平显著下降，上调其表达可通过作用靶基因c-Myb改善心肌纤维化。李冰等[11]研究发现，房颤患者射频消融术前血浆miR-150水平较健康体检者显著降低，术后miR-150水平较术前显著升高，miR-150可能与房颤的发病机制相关，并能调控疾病的发展。本研究结果显示，与对照组比，房颤患者血清miR-133a水平显著升高，miR-150水平显著降低。除此之外，不同类型的房颤患者血清miR-133a和miR-150比较差异也显著，提示miR-133a和miR-150均参与房颤的发生、发展过程，与疾病的严重程度相关。 血清作为生物检测的样本，具有取材方便、无创伤等优点，因此，血清miRNA可作为诊断房颤或其他疾病发生的生物标记物。本研究结果显示，miR-133a、miR-150单独诊断房颤发生具有一定的灵敏度和特异度，二者联合诊断时灵敏度和特异度显著提高，AUC增加，提示miR-133a和miR-150联合检测对于房颤的诊断具有较大的参考价值。

心房结构重构在房颤发生和维持过程中起重要作用。心房间质纤维化会导致心肌壁变薄、心房扩张、心房结构重构等[12]。房颤患者心房明显纤维化，且随着纤维化程度越严重，房颤发生的可能性也越大。研究发现，MMP-9参与心肌纤维化，影响心肌结构重置[13]。本研究结果显示，房颤患者MMP-9水平较对照组显著升高，且不同类型房颤患者MMP-9水平比较差异显著，与相关研究报道一致[13,14]。房颤患者血清miR-133a与MMP-9呈正相关，miR-133a过表达可能通过抑制胰岛素1号生长因子介导MMP-9表达上调，参与房颤患者心房结构重构和胶原代谢。超敏C-反应蛋白（hsCRP）与心血管疾病关系密切，hsCRP在房颤炎性标志物的临床应用中最为广泛。李砚杰等[15]研究发现，房颤患者hsCRP较对照组显著增加，且阵发性、持续性、永久性房颤患者之间比较差异显著，与本研究结果一致。本研究结果还显示，房颤患者血清miR-133a与hs-CRP呈正相关，miR-150与hs-CRP呈负相关，提示miR-133a和miR-150也可作为血清标志物用于判断房颤患者严重程度的参考指标。房颤过程与心房结构改变相关，研究证实，房颤患者心房直径增加。本研究结果显示，房颤患者左心房内径较对照组增加，且不同类型患者之间比较差异显著，与报道结果一致[16]。房颤患者血清miR-133a与左心房内径呈正相关，miR-150与左心房内径呈负相关，提示miR-133a和miR-150可能通过影响基质金属蛋白酶活性、间质纤维化等进而增加心房直径。

综上所述，房颤患者血清miR-133a和miR-150均表达异常，参与房颤发生、发展。联合检测血清miR-133a和miR-150有望作为房颤患者发生风险的生物学标志物，通过深入研究miR-133a和miR-150在该疾病中的作用机制，可为房颤治疗提供新的药物作用靶点。