植物乳杆菌和含水量对辣木叶青贮品质和单宁含量的影响

王成，王益，周玮，骈瑞琪，张庆*，陈晓阳*

(1.华南农业大学动物科学学院，广东 广州510642;2.华南农业大学林学与风景园林学院，广东木本饲料工程技术研究中心，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东广州510642)

目前，我国传统蛋白质饲料资源严重短缺且价格昂贵，蛋白饲料主要依赖于进口，这已成为制约畜牧业发展的主要因素。因此，寻求价廉、高产和高效的新型蛋白饲料，以期完全或部分替代传统蛋白饲料成为动物营养学研究的热点。辣木(Moringa oleifera)是一种起源于印度北部的热带、亚热带植物，已在我国广东、广西、海南、四川和云南等地大规模种植。其特点是年产量高，鲜重年产量约126 t·hm-2[1]，干物质年产量10.4～20.7 t·hm-2[2];蛋白含量高且纤维含量低，Teixeira等[3]研究显示辣木叶粉中含有28.7%的粗蛋白、7.1%的脂肪、44.4%碳水化合物以及各类维生素和矿物元素，符合优质蛋白质饲料的基础，可以开发成为一种新型的植物性蛋白质饲料[4]。近年来，多项研究发现，可以将辣木叶作为蛋白来源和饲料组分应用到动物生产中，主要在山羊[5-7]、绵羊[8]以及其他反刍动物[9-10]中，有着积极的效果。但报道使用的多为辣木叶粉，青贮使用较少，辣木叶粉需要经过晾干粉碎处理，成本提高，且南方雨水较多，辣木叶粉容易受潮发霉，增加了处理难度。而青贮调制不受天气影响，成本低廉，青贮过程还可以降低原料的抗营养因子[11]，有利于辣木叶的长期保存。乳酸菌作为一种发酵促进剂，能够促进青贮初期尽快进入乳酸发酵阶段，促进单糖物质转化为乳酸，使p H迅速降低，同时抑制蛋白质的水解作用，降低氨态氮(NH3-N)，乙酸(AA)和丁酸(BA)浓度，减少酵母菌和霉菌的滋生[12]。除添加剂外，青贮原料本身的含水量和青贮时间也是影响青贮品质的重要因素，含水量太高，青贮过程中会产生大量渗出液，易引起梭菌发酵;含水量太低，不利于压实，引起好氧霉变，使营养物质大量损失[13-14]。

含水量和添加乳酸菌对于常规牧草青贮品质的影响报道较多，而辣木作为木本植物，通过青贮技术应用于饲料生产的研究鲜有报道。本试验在不同含水量的青贮辣木中添加乳酸菌，在发酵60和120 d测定辣木的青贮品质和单宁含量，研究乳酸菌添加剂和含水量对辣木叶青贮品质的影响，以期为辣木叶的青贮调制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的辣木品种为PKM-1，于云南辣木种子资源库采种，2016年8月种植于华南农业大学稻香园试验田，2017年7月采叶，然后进行不晾晒(含水量约为75%)和晾晒3 h(含水量约为70%)，晾晒12 h(含水量约为60%)处理。试验所用的乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，LP)，由中国农业大学青贮实验室研发。

1.2 试验设计

本验采用双因素完全随机设计，因素一为添加乳酸菌，添加量为1×106cfu·g-1鲜样(fresh matter，FM)，将不添加作为对照(CK)组;因素二为含水量，分3个水平，75%(DM1)、70%(DM2)和60%(DM3)。采集新鲜辣木原料，用铡刀切成3～4 cm的小段后，分别晾晒0、3和12 h后，将植物乳杆菌添加剂喷洒于不同含水量原料上，对照组喷洒等量的蒸馏水，混合均匀后装到聚乙烯塑料袋(20 cm×30 cm)中，每袋180 g左右，真空封口机除去空气并密封保存。一共6个组，每组6个重复，共36袋。分别在青贮的60和120 d后开袋，对其化学成分、发酵品质进行测定分析。

1.3 试验指标测定

1.3.1 营养指标 粗蛋白质(CP)测定:凯氏定氮法[15]。

非蛋白氮(non-protein nitrogen，NPN)测定:三氯乙酸溶液混合发酵后的辣木叶干粉，无损的取定量滤纸过滤后的沉淀，烘干后用凯氏定氮法测定含氮量即非蛋白氮[16]，真蛋白(true protein，TP)，TP=CP-NPN，通过凯式定氮仪分别测定粗蛋白质(CP)和非蛋白氮(NPN)。

氨态氮(NH3-N)测定:苯酚-次氯酸钠比色法[17]。

游离氨基酸氮(FAA)测定:茚三酮-硫酸肼比色法[18]。

酸性洗涤纤维(ADF)和中性洗涤纤维(NDF)测定:范氏纤维测定法[19]。

1.3.2 发酵品质和微生物数量 p H值测定:开袋后，取代表性青贮样品20 g，加入180 m L蒸馏水，混合均匀，经家用榨汁机榨汁1 min，依次用4层纱布和中速定性滤纸过滤，得到浸提液，采用p H计(PHS-3C，上海雷磁)测量p H值[20]。

有机酸的测定:浸提液经0.22μm孔径的滤膜过滤得到滤液，采用岛津GC-14型高效液相色谱仪(色谱柱:Shodex Rspak KC-811 s-DVB gel column，日本;检测器:SPD-M10AVP)测定乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)含量，流动相为3 mmol·L-1高氯酸，流速1 m L·min-1;柱温为50℃;检测波长为210 nm，进样量为5μL[21]。

干物质和可溶性碳水化合物测定方法:干物质(将青贮辣木叶混合均匀后，称重取样放在65℃恒温烘箱中，烘至绝干，计算烘干前后的重量比值，即为干物质);可溶性碳水化合物(蒽酮比色法测定。制作葡萄糖标准曲线，将样品煮沸10 min，冷却过滤定容，经吸取摇匀后加入蒽酮，在620 nm波长下比色测定吸光度来测得)。

乳酸菌、酵母菌和大肠杆菌数量测定:取代表性样品20 g，加入180 m L灭菌的生理盐水，均匀混合后逐级稀释。微生物数量测定采用平板计数法，乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌分别采用MRS琼脂培养基[蛋白胨10.0 g;牛肉浸粉5.0 g;酵母提取物4.0 g;葡萄糖20.0 g;吐温-80，1.0 m L;磷酸氢二钾2.0 g;乙酸钠5.0 g;柠檬酸三铵2.0 g;七水合硫酸镁0.2 g;四水合硫酸锰0.05 g;琼脂15.0 g;最终p H值(6.2±0.2)]、结晶紫中性红胆盐琼脂[VRBA，蛋白胨7.0 g;酵母提取物3.0 g;乳糖10.0 g;氯化钠5.0 g;胆汁盐3号1.5 g;中性红0.03 g;结晶紫0.002 g;琼脂15.0 g;最终p H值(7.4±0.2)]、孟加拉红培养基(虎红琼脂)(蛋白胨5.0 g;葡萄糖10.0 g;磷酸氢二钾1.0 g;七水合硫酸镁0.5 g;琼脂15.0 g;孟加拉玫瑰红0.033 g;氯霉素0.1 g)进行培养计数，乳酸菌用厌氧培养箱，酵母菌和大肠杆菌用生化培养箱，30℃培养24 h后计数[22]。

1.3.3 单宁含量测定 水解单宁:用70%丙酮，超声波处理，离心并收集上清液，用没食子酸(广州添资生物科技有限公司，广州)为标准品绘制标准曲线，采用Folin-Ciocalteu试剂比色法测定总酚和简单酚含量，总酚减去简单酚即为水解单宁含量;缩合单宁:20 mg样品加10 m L丙酮-丁醇-氯化氢试剂，70℃水浴2.5 h，冷却后8000 r·min-1离心5 min，554 nm测OD值，以原花青素(广州添资生物科技有限公司，广州)为标准品制作标准曲线，计算缩合单宁含量[23]。

1.4 数据统计

采用SPSS 18.0进行双因素方差分析(Two-way AVOVA)，两个因素互作显著时用Duncan氏对各组进行多重比较，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 辣木原料的特性

辣木叶原料CP含量为16.72%，WSC含量较高为10.72%，NDF和ADF分别为31.24%和24.23%，水解单宁和缩合单宁分别是1.86%和1.48%，原料中微生物含量丰富，乳酸菌和大肠杆菌数量分别是4.63和4.81 log cfu·g-1FM(表1)。

表1 辣木叶原料的特性Table 1 The characteristics of M.oleifera leaves material

2.2 辣木叶青贮60 d指标测定

2.2.1 植物乳杆菌和含水量对60 d青贮辣木叶青贮品质的影响 由表2可知，辣木叶青贮发酵60 d，75%和60%水分组添加LP后，p H值显著下降(P＜0.05)，70%水分组添加LP后p H值显著上升(P＜0.05)，70%和60%水分组添加LP后AA和PA含量显著升高(P＜0.05)，70%水分组添加LP后的LA含量显著升高(P＜0.05);大肠杆菌的数量小于2.0 log cfu·g-1FM。方差分析结果表明，水分对于各个指标(ADF、NDF含量和大肠杆菌数量除外)均有极显著的影响(P＜0.01)，添加LP对p H值，AA，PA含量和乳酸菌数量有极显著的影响(P＜0.01)，对LA含量有显著的影响(P＜0.05)，二者的交互作用对p H值、乳酸菌数目，LA和PA含量有极显著的影响(P＜0.01)。

表2 植物乳杆菌和含水量对60 d辣木叶青贮品质的影响Table 2 Effect of moisture and LP treatment on character of silage M.oleifera leaves in 60 d

2.2.2 植物乳杆菌和含水量对60 d青贮辣木叶单宁含量的影响 由表3可知，辣木叶青贮发酵60 d后，添加LP和3个含水量处理对单宁酸含量均无显著影响。

表3 植物乳杆菌和含水量对60 d青贮辣木叶单宁含量的影响Table 3 Effect of moisture and LP treatment on the Tannin contents of silage M.oleifera leaves in 60 d(%DM)

2.2.3 植物乳杆菌和含水量对60 d青贮辣木叶营养价值的影响 由表4可知，辣木叶青贮发酵60 d后，60%含水量组相比于75%和70%水分组，TP含量显著降低(P＜0.05)，FAA和NH3-N含量显著升高(P＜0.05);添加LP和3个水分处理对CP含量无显著影响。70%水分组添LP后，TP含量显著降低(P＜0.05)，NPN含量显著增加(P＜0.05)。方差分析结果表明，含水量对于NPN、TP、FAA、NH3-N的含量有极显著的影响(P＜0.01)，对CP含量有显著影响(P＜0.05);添加LP对NPN和NH3-N的含量有极显著的影响(P＜0.01)，对TP含量有显著影响(P＜0.05);水分和植物乳杆菌的交互作用对NPN有显著影响(P＜0.05)。

表4 植物乳杆菌和含水量对60 d青贮辣木叶营养价值的影响Table 4 Effect of moisture and LP treatment on nutrition value of silage M.oleifera leaves in 60 d(%DM)

2.3 辣木叶青贮120 d指标测定

2.3.1 植物乳杆菌和含水量对120 d青贮辣木叶青贮品质的影响 由表5可知，60%含水量组相比于75%和70%水分组，LAB数目显著降低(P＜0.05)，AA、PA、NDF和ADF含量显著升高;各个水分组添加LP后p H值和酵母菌数目均降低但并不显著，75%和70%含水量组添加LP后LAB数目显著降低(P＜0.05)，70%含水量添加LP后LA含量显著升高(P＜0.05)并且各个水分组的AA和PA含量均有显著升高(P＜0.05);在75%和70%含水量下添加LP后NDF和ADF含量显著升高(P＜0.05)。方差分析结果表明，水分对LAB数目，PA、NDF和ADF含量有着极显著的影响(P＜0.01)，对LA和AA含量有显著影响(P＜0.05);添加LP对p H值以及AA和PA含量有极显著影响(P＜0.01)，对LAB数量，LA、NDF和ADF含量有显著影响(P＜0.05)，二者的交互作用对p H值有极显著影响(P＜0.01)。

表5 植物乳杆菌和含水量对120 d青贮辣木叶青贮品质的影响Table 5 Effect of moisture and LP treatment on character of silage M.oleifera leaves in 120 d

2.3.2 植物乳杆菌和含水量对120 d青贮辣木叶单宁含量的影响 由表6中方差分析结果表明，水分以及二因素的交互作用对水解单宁含量有极显著影响(P＜0.01)。

表6 植物乳杆菌和含水量对120 d青贮辣木叶单宁含量的影响Table 6 Effect of moisture and LP treatment on the Tannin contents of silage M.oleifera leaves in 120 d(%DM)

2.3.3 植物乳杆菌和不同含水量对120 d青贮辣木叶营养价值的影响 由表7可知，60%含水量组相比于70%含水量组，TP含量显著降低(P＜0.05)，FAA和NH3-N含量显著升高(P＜0.05);70%含水量组添加LP后，TP含量有显著降低(P＜0.05)，NPN含量显著升高(P＜0.05);75%和70%含水量组添加LP后，NH3-N和FAA含量显著升高(P＜0.05)。方差分析结果表明，水分对各个指标(CP除外)均有极显著影响(P＜0.01);植物乳杆菌对NPN和TP含量有极显著影响(P＜0.01)，对NH3-N和FAA含量有显著影响(P＜0.05);二者的交互作用对TP含量有极显著影响(P＜0.01)，对NPN含量有显著影响(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 辣木叶作为青贮原料的特点

本试验中使用的辣木叶原料CP为16.72%，低于刘昌芬等[24]报道的27.5%，这可能是不同的地理位置、品种、收获时间导致辣木叶营养物质含量不同。辣木叶原料NDF和ADF分别为31.24%和21.23%，均低于热带木本饲用灌木的平均含量[25](NDF:38.83%;ADF:33.67%);WSC为10.72%，张庆[26]报道，WSC是能否成功制作优质青贮饲料的关键，青贮原料中WSC一般需达到6%～7%以上，青贮饲料才能良好保存。本试验中，辣木叶原料WSC为10.72%，这可能是辣木叶易于调制青贮饲料的原因。

3.2 含水量对青贮品质的影响

青贮原料的含水量是影响饲料营养品质和青贮发酵品质的重要条件之一。本试验中，辣木叶青贮发酵60和120 d时，与75%和60%含水量组相比，70%含水量组的NPN含量显著降低，TP含量显著升高;与60%含水量组相比，70%含水量组的FAA和NH3-N含量显著升高。可见辣木叶青贮过程中，大量的蛋白质降解成非蛋白氮。青贮饲料中蛋白质的变化，除了与梭菌等有害菌的活动有关外，最主要的是植物中所含的蛋白质水解酶的作用[27]，并且蛋白酶的活性受到p H的影响。在适宜含水量条件下青贮时，干物质和可溶性碳水化合物含量较高，能够增加发酵底物，快速降低p H得到较高的LA含量[28]，而原料含水量过高导致腐败菌的滋生，同时产生的渗出液会使饲草养分流失较多[29]，含水量过低又会使介质中水的活性降低，自身的产酸菌处于生理干旱状态，酸度积累受到抑制，影响青贮的效果。因此NPN含量的降低，原因可能是酸性环境对蛋白酶活性的抑制作用以及适宜含水量减少腐败菌的滋生。发酵60 d时，70%含水量组相比于60%含水量组，LAB和Yeasts的数目显著升高，大肠杆菌数目小于2.0 log cfu·g-1FM，而LP，AA和PA含量均显著降低，说明70%含水量组有利于乳酸菌等微生物的繁殖，这与张德玉等[30]研究结果一致。含水量低的青贮辣木叶的NDF和ADF含量整体高于含水量高的青贮，这可能是各水分组间青贮原料干物质含量差异引起的。发酵60和120 d时，70%含水量组相比于60%含水量组，NH3-N和FAA含量显著降低，同时NH3-N/TN(总氮)小于10%，说明70%水分条件下辣木叶青贮发酵中蛋白质分解程度低，符合优质饲料标准[22]。

3.3 添加植物乳杆菌对青贮品质的影响

在青贮过程中的乳酸菌数量需要达到1×105cfu·g-1才可以使p H迅速降低，抑制有害微生物的生长，减少青贮饲料营养物质的消耗、分解和流失，同时减少胺等有毒物质的产生，保证青贮料的质量[32-33]。本试验中，添加植物乳杆菌后，在辣木叶青贮发酵的60和120 d时，与CK组相比，70%含水量组TP含量显著降低，NH3-N和FAA显著升高。添加LP后，辣木叶青贮品质虽有改善，但效果不太明显，这可能是添加的乳酸菌与辣木叶原料中的乳酸菌产生了拮抗作用，这也导致了LP处理后70%含水量组中乳酸菌数量相比于CK组显著降低，Wohlt[33]也发现了类似的现象。另一方面，辣木叶中含有丰富的酚类化合物，具有抗菌活性[34-35]，这也可能是导致添加乳酸菌对辣木叶青贮发酵品质改善效果不够显著的原因。与CK组相比，70%含水量组的有机酸(LA、AA和PA)含量显著升高，原因可能是添加植物乳杆菌，使得PH迅速降低，抑制其他微生物的生长，有利于乳酸等有机酸的积累，这与玉柱等[36]，田瑞霞等[37]的研究结果一致。

3.4 添加植物乳杆菌和含水量对单宁含量的影响

单宁是植物性饲料原料中一种重要的抗营养因子，主要表现在减少动物采食量，降低营养物质的生物利用率及产生毒害作用[38-39]。同时，单宁对动物的生长具有多种生理活性，如止血、抑制微生物、抗过敏、抗突变、抗衰老等作用[40]。根据化学结构的不同，单宁通常分为水解单宁(棓酸酯类多酚)和缩合单宁(聚黄烷醇类多酚或原花色素)[41-42]。本试验发现:辣木叶直接青贮60和120 d后对单宁含量有一定的降低作用，这可能是因为青贮饲料中丰富的微生物产生了单宁酶[43]，单宁酶的活性受p H影响很大，刘如石等[43]和郭鲁宏等[19]研究发现，单宁酶活性的最适p H为6.0～6.5。因此，可能是青贮过程的酸性内环境影响了单宁酶的活性，导致单宁降解变化不显著。

4 结论

辣木叶饲用价值较高且易于调制青贮饲料。青贮时适宜含水量和添加植物乳杆菌均可提高辣木叶发酵品质，研究发现以70%含水量为最佳，显著降低氨态氮(NH3-N)和氨基酸类游离氮(FAA)含量，显著增加真蛋白质(TP)和乳酸菌(LAB)含量;添加植物乳杆菌后，可以显著增加有机酸(LA、AA和PA)的含量。研究还发现添加植物乳杆菌(LP)和调整不同含水量可以降低青贮辣木叶单宁含量，但影响不显著。