同/异型发酵乳酸菌对全株玉米青贮营养成分和瘤胃降解特征的影响

李菲菲，张凡凡，王旭哲，苗芳，马春晖

(石河子大学动物科技学院，新疆 石河子832000)

玉米(Zea mays)青贮作为反刍家畜的基础日粮，其营养品质佳、发酵特性好且储藏时间长，是当今世界最为重要的反刍动物饲料源之一。当前，为提高玉米青贮的发酵特性与营养品质，国内外玉米青贮调制的常用方法主要利用各类微生物制剂，其中乳酸菌菌剂作为最为安全有效的添加剂常被应用于各类青贮饲料的发酵[1]。乳酸菌制剂是指多用于饲草青贮的一类乳酸菌添加剂，其主要目的是调节青贮原料中的微生物区系，加快发酵进程，促进乳酸的产生以降低p H值，抑制有害微生物的生长增殖从而保存青贮料的营养成分[2]。此外，青贮饲料中添加乳酸菌制剂能够软化青贮原料纤维，提高反刍动物的消化率，并增强青贮饲料的适口性[3]。目前，乳酸菌按照发酵类型可分为同型发酵和异型发酵乳酸菌，同型发酵乳酸菌如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、粪链球菌(Enterococcusfaecium)和戊糖片球菌(Pediococcus acidilactici)等[4];异型发酵乳酸菌如短乳杆菌(Lactobacillus breris)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)等[5]。其中同型发酵乳酸菌消耗能量低，能迅速降低青贮饲料的p H，然而其发酵产生的挥发性脂肪酸含量较低，不能有效抑制霉菌和酵母菌等的生长，从而造成青贮饲料的腐败和诸多负面影响[6-8]。异型发酵乳酸菌虽然消耗底物的能量较多，但其可产生大量抑制真菌生长的乙酸，从而提高青贮饲料的有氧稳定性，并可有效防止二次发酵，通过此过程可弥补发酵造成的潜在营养损失[9-11]。研究发现，添加植物乳杆菌可显著提高玉米青贮干物质的快速降解部分，降低全株玉米青贮料中的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，显著增加其主要营养成分的瘤胃有效降解率。添加布氏乳杆菌可显著降低酵母数量提高青贮饲料有氧稳定性。所以控制青贮中同/异型发酵乳酸菌的种类、比例和发酵量可能是造成其是否有影响的关键因素[12-14]，而对于其营养成分的影响是否会改善反刍家畜的消化率，是本研究的重点。针对此，本研究以全株玉米青贮为研究对象，探究不同发酵类型乳酸菌制剂对全株玉米青贮发酵营养成分及其瘤胃降解率的影响，旨在提高全株玉米青贮的实际营养价值，筛选改善效果较好的乳酸菌制剂，为青贮玉米饲料的优质高效生产提供指导，并为我国乳酸菌发酵菌剂的自主研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及试验材料

试验以新疆农垦科学院选育的新饲玉10号(Zea mays cv.‘Xingsiyu NO.10’)饲用玉米为研究材料，试验地位于新疆石河子大学牧草实验站(N 44°20′E，88°30′，海拔420 m)，当地为典型的大陆性干旱气候。前茬作物为棉花(Gossypium spp.)。青贮玉米种植时间为2016年4月12日-2016年8月22日(生长期为112 d)，玉米种植为穴播，密度按照宽窄行处理，种植面积为1050 m2，灌水方式采用滴灌，按照一般青贮玉米种植管理模式进行管理。在青贮玉米进入乳熟末期至蜡熟初期(玉米乳线超过2/3)时进行全株刈割，当场粉碎至2 cm左右长度。立刻进行真空袋法调制青贮(真空袋规格40 cm×50 cm)。

青贮乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)添加剂为:同型发酵LAB:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，ACCC 11016)和戊糖片球菌(Pediococcus acidilactici，ACCC 05481)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)。异型发酵LAB:布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri，CICC 20293)，菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。

1.2 试验设计

设计4种处理，Ⅰ、同型发酵LAB处理(T处理):植物乳杆菌和戊糖片球菌复合添加，添加量为1∶1，1×105cfu·g-1;Ⅱ、异型发酵LAB(Y处理):布氏乳杆菌，添加量为1×105cfu·g-1;Ⅲ、同型+异型发酵LAB(TY处理):植物乳杆菌、戊糖片球菌和布氏乳杆菌，添加量为1∶1∶1，1×105cfu·g-1;Ⅳ、不加任何菌剂对照(CK处理)。各种LAB在MRS液体培养基(主要成分)中富集培养，通过平板计数后确定数量，按比例配置好后，用灭菌喷壶均匀的喷洒至待贮玉米表面(CK处理喷洒等量的去离子水)。喷洒完毕后立刻进行青贮。青贮共调制16袋(每个处理4袋)，每袋2 kg，实验室环境(23～30℃)下发酵60 d。在第60天时开袋，从各青贮样品中随机挑选3袋测定各处理的营养成分及其反刍动物瘤胃消化率。

1.3 指标分析方法

营养成分主要测定干物质(dry matter，DM)、粗蛋白(crude protein，CP)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)、粗脂肪(ether extract，EE)、粗灰分(crude ash，Ash)和淀粉(starch，Sta)。各指标均按照国标进行测定[15-18]，其中采用重量法测定DM，采用凯氏定氮法测定CP，采用蒽酮-硫酸比色法测定WSC，采用范氏(Van Soest)洗涤纤维法测定NDF和ADF，采用索氏浸提法(乙醚浸出法)测定EE，采用灰化法测定Ash，采用酶水解法测定Sta。

采用瘤胃瘘管尼龙袋法分析玉米青贮营养成分瘤胃消化率[15]。选用3只体重体型相似[(52±2.5)kg]生长状况良好的哈萨克羊，安装永久性瘤胃瘘管。安装瘘管后正常饲喂1个月，期间检查安装瘘管羊的适应情况。试验前采用青贮玉米饲料预饲一周，每只羊每天定量饲喂200 g精料(由天康公司提供:精料成分为玉米51%、麸皮24%、豆粕18%、尿素1.5%、食盐1%、碳酸氢钙2.5%、添加剂2%)，青贮玉米1.8 kg，自由饮水。试验开始后将各处理样品再次干燥(65℃)至恒定过筛(69μm)，准确称取3 g样品(±0.01 g)放入尼龙袋中(尺寸6 cm×9 cm，孔径40～50μm)，填装后用尼龙线扎口绑在铁链上。于晨饲前(8:00)进行投放，共设置5个时间点(12、24、36、48、72 h)，到相应时间后将尼龙袋取出迅速洗净测定DM、NDF、ADF和有机物(organic matter，OM)含量，OM含量为:OM%=1-Ash%(即:有机物含量=1-无机物含量)。

1.4 数据分析

青贮玉米瘤胃降解率计算方法为(1)式[19]，降解特征参数计算为(2、3)式[20]:

式中:Dx为待测青贮玉米某成分的瘤胃降解率(%);Ma为待测青贮料青贮玉米某成分含量(g);Mb为过瘤胃残留物中某成分含量(g);Dp为青贮玉米中某成分在瘤胃内停留时间t(h)的瘤胃降解效率，A为快速降解部分(rapid degradation，%)，B为慢速降解部分(slow degradation，%)，A+B为潜在降解部分(potential degradation，%)，C为慢速降解部分的降解速率(B degradation rate，%·h-1)，ED为某成分在瘤胃内的有效降解率(effective degradation rate)，k为粗饲料瘤胃外流速率常数(%·h-1)，本研究k值取4.5%·h-1。采用Matlab软件进行偏最小二乘计算，求得各相关参数。

利用公式(1～3)折算成对应指标降解率(degradation)，即干物质降解率(dry matter degradation，DMD)、中性洗涤纤维降解率(neutral detergent fiber degradation，NDFD)、酸性洗涤纤维降解率(acid detergent fiber degradation，ADFD)、有机物降解率(organic matter degradation，OMD)。采用Excel 2007软件进行所有数据的初步整理，采用SPSS 22.0软件进行数据的F检验，当通过F检验后进行单因素(One-way ANOVA)和双因素(Two-way ANOVA)方差分析，通过单因素方差分析计算不同处理间差异性，双因素方差分析计算发酵60 d和处理两个因素及其交互作用影响的显著性，多重比较方法均采用Duncan法。采用隶属函数评价法评价出最佳处理[21]，具体公式为:

式中:X为样品各指标测定值;UX(+)为各指标呈正相关隶属函数值;UX(-)为各指标呈负相关隶属函数值。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌处理对玉米青贮各营养成分含量的影响

如表1所示，全株玉米青贮原料DM含量为40.36%，CP含量为8.26%，Sta含量为29.83%，NDF含量为47.98%，ADF含量为31.32%，WSC含量为22.01%，Ash含量为9.26%，EE含量为7.58%。青贮发酵60 d时，各处理营养成分与青贮原料间存在一定差异，其中仅Ash和EE略高于青贮原料，其余营养指标均低于青贮原料。各处理间在营养指标上有显著差异(P＜0.05)，其中DM含量按高低排序为Y处理＞T、TY处理＞CK处理(P＜0.001)，CP和Sta含量各试验处理均极显著高于CK处理(P＜0.01)，NDF含量按优劣排序为Y处理＞T处理＞TY处理＞CK处理(P＜0.001)，ADF含量按优劣排序为Y处理＞TY处理＞T处理＞CK处理(P＜0.001)，WSC和EE含量按高低排序均为Y处理＞TY处理＞T处理＞CK处理(P＜0.001)，Ash含量按高低排序为CK处理＞T处理＞Y处理(P=0.009)，而T、Y处理与TY处理间差异不显著(P＞0.05)。

表1 不同处理对玉米青贮营养成分的影响Table 1 Effects of different treatments on nutritional quality of plant corn silage

2.2 不同乳酸菌处理对瘤胃降解率的影响

如表2所示，瘤胃中12 h时，Y处理DMD、NDFD和OMD最高(P＜0.05)，ADFD最高为CK和T处理，其二者之间差异不显著(P＞0.05)，T和Y处理间差异也不显著(P＞0.05)。瘤胃中24 h时，DMD最高的为CK和T处理，二者显著高于其余处理(P＜0.05)，NDFD和OMD最高的均为Y处理(P＜0.05)，ADFD最高的为Y处理，其显著高于CK和T处理(P＜0.05)，但较TY处理差异不显著(P＞0.05)。瘤胃中36 h时，DMD最高的为T和Y处理，二者显著高于其他处理(P＜0.05)，NDFD、ADFD和OMD最高的均为Y处理，其显著高于其余处理(P＜0.05)。瘤胃中48 h时，各指标最高的均为Y处理，其显著高于其余各个处理(P＜0.05)，仅ADFD中Y和TY处理差异不显著(P＞0.05)。瘤胃中72 h时，各指标最高的均为Y处理，其显著高于其余各个处理(P＜0.05)。双因素方差分析结果表明，处理(M)、时间(H)以及M和H的交互作用(M×H)对各指标均有极显著的影响(P＜0.01)。

2.3 不同乳酸菌处理对玉米青贮各营养成分瘤胃降解参数的影响

通过对玉米青贮各营养成分(DM、NDF、ADF、OM)在瘤胃中的降解模型特征参数分析，结果表明(表3)，各营养成分基本含量同开窖60 d时的情况(表1)，其中DM降解参数中，CK和Y处理快速降解部分(A)显著高于T和TY处理(P=0.021);CK处理慢速降解部分(B)和潜在降解部分(A+B)显著高于其余各处理(P＜0.05);B的降解速率(C)最高的为T处理，其显著高于其余各处理(P＜0.05)，CK处理显著高于TY处理(P＜0.05)，Y处理与CK和TY处理差异不显著(P＞0.05);DM有效降解率，T和Y处理显著高于CK和TY处理(P=0.007)。NDF降解参数中，T和Y处理下A显著高于CK和TY处理(P=0.027);各处理下B和A+B按大小排序为，TY处理＞Y处理＞T处理＞CK处理(P＜0.05);各处理之间C的差异不显著(P=0.227);NDF有效降解率，T和Y处理显著高于CK和TY处理(P=0.009)。ADF降解参数中，T和Y处理下A显著高于CK和TY处理(P=0.006);各处理B、A+B、C和ADF有效降解率之间差异均不显著(P＞0.05)。OM降解参数中，Y处理A显著高于其余处理(P＜0.05)，CK处理A显著高于T处理(P＜0.05)，而TY处理下A较CK和T处理差异均不显著(P＞0.05);CK和Y处理下B显著高于T处理(P＜0.05)，但较TY处理相比差异不显著(P＞0.05)，且T和TY处理间差异不显著(P＞0.05);A+B按大小排序为CK和Y处理＞T和TY处理(P=0.027);Y处理C与T处理相比差异不显著(P＞0.05)，但显著高于CK和TY处理(P＜0.05)，T处理与CK和TY处理间差异均不显著(P＞0.05);OM有效降解率，Y处理显著高于其余各处理(P=0.003)。

表2 不同处理对玉米青贮瘤胃降解率的影响Table 2 Effects of different treatments on rumen regeneration of plant corn silage(%)

表3 不同处理玉米青贮瘤胃中各指标的降解率和降解参数Table 3 The digestibility and digestibility coefficients of corn silage with different treatments

2.4 不同乳酸菌处理玉米青贮各指标的综合价值评价

由于各处理在不同指标上表现均不相同，而以任何一个单一指标评价最佳发酵处理均是不全面的[21]。因此，对12项营养成分和瘤胃降解率特征指标进行隶属函数分析，其中NDF、ADF为负向指标(即含量越高质量越差)，其余均为正向指标。隶属函数值综合价值评价中，平均值越大综合价值越高，各处理综合价值按高低排序为:Y处理(0.76)＞T处理(0.62)＞TY处理(0.37)＞CK处理(0.16)(表4)。

3 讨论

3.1 同/异质型乳酸菌添加对玉米青贮营养指标的影响

青贮的营养成分是评价青贮饲料最为直接的指标。其中DM含量作为青贮玉米底物营养成分的基础尤为重要。以往研究表明，青贮玉米中添加乳酸菌菌剂均可显著提高DM含量[4]，且接种布氏乳杆菌在提高不带穗玉米秸秆青贮的DM含量方面最为有效[12]，本研究中加入各种乳酸菌处理的DM含量也显著高于不加菌剂处理，且其中添加布氏乳杆菌(Y处理)提高DM含量最为显著，这证实了以往研究论点。开窖时CP含量较发酵前相比均有所下降，而添加乳酸菌处理均显著高于不加菌剂处理，其原因主要为青贮发酵过程是多种微生物参与的体系，在各类微生物(好氧/厌氧)的共同作用下，底物中蛋白物质被大量消耗，转化成氨态氮和胺类物质;但由于外源添加的乳酸菌在发酵过程中占主导地位，其一方面降低了蛋白向氨态氮转化的效率(即降低氨态氮含量)[8-9];另一方面，其繁殖产生的菌体蛋白可增加青贮体系的蛋白含量[22]。此外，有学者在不同干物质含量的苜蓿(Medicago sativa)青贮中接种乳酸菌也得到了相同的结论[23]。添加各乳酸菌处理均提高青贮体系Sta含量，其说明乳酸菌有利于提高青贮体系Sta含量，同时也佐证了添加不同发酵类型乳酸菌青贮可显著提高奶牛奶产量(Sta含量与奶产量呈正相关)[4，22]。有学者在大麦(Hordeum vulgare)、桑叶(Morus alba)和全株青贮玉米中添加不同发酵类型乳酸菌，结果表明NDF和ADF含量均显著下降[23-26]，本研究得到相同结论。另外本研究表明布氏乳杆菌在降低NDF和ADF含量方面效果最为显著，原因可能是布氏乳杆菌的繁殖产生阿魏酸酯酶(feruloyl esterase，FE)，其可水解木质素和半纤维素之间的阿魏酸酯键，破坏纤维结构，从而降低纤维的含量，并在一定程度上改善饲料的纤维可消化性[27]。对于本研究中Ash和EE含量发酵前后的变化规律，与苗芳等[21]得到的试验结果相似，而产生这一规律的原因目前还尚未明确[28]，有待继续探索。

表4 各处理全株玉米青贮隶属函数分析及综合价值排序Table 4 Analysis and comprehensive value rank withdifferent treatments on the membership function of all silage corn

3.2 同/异质型乳酸菌添加对绵羊瘤胃降解率的影响

反刍动物对粗纤维的消化利用主要是通过瘤胃中微生物的降解来进行的，测定NDF和ADF的表观消化率，能在一定程度上反映出瘤胃微生物对纤维的消化降解情况。有研究发现豌豆(Pisum sativum)和小麦(Triticum aestivum)青贮中添加布氏乳杆菌提高了瘤胃氮降解营养成分的能力和NDFD，但不显著影响ADFD和DMD[29-30]，本研究得到相似结论，NDFD随瘤胃停留时间的延长(12～72 h)逐渐升高，此外本研究中DMD、OMD也随瘤胃停留时间的延长逐渐升高，这与Aksu等[30]研究结果相同。另有研究对稻贮中添加微生态制剂(乳酸菌)，其较不添加相比DMD、ADFD和NDFD随之升高[31]，本研究也得到了相同的结果。所以对于青贮底物(饲草)、乳酸菌(不同发酵类型)接种剂量以及发酵时间的不同均可导致瘤胃降解率产生很大变化。另外，有研究表明在不同菜渣青贮中添加植物乳杆菌后，仅有部分菜渣体外消化率有所升高[32]，其在证实了上述猜测的同时，也表明并不是所有作物或农副产品均适宜青贮发酵，控制发酵底物的含水量和营养成分比例可能是导致出现不同结果的主要原因。此外，微生物尤其是乳酸菌在发酵体系中的作用规律不容忽视，在青贮饲料发酵初期片球菌起着非常重要的作用，植物原料在收获制作成青贮饲料后，最先进行发酵的是粪链球菌和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，接着被更耐酸的菌株，如植物乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌等取代[33]。本试验中ADFD和NDFD均显著增加，另一个主要的方面是利用乳酸菌制剂处理后，青贮过程中的乳酸菌数量显著增加，发酵速度加快，产生大量的乳酸，降低青贮料的p H值，进而抑制有害微生物的活性，提高其营养成分在瘤胃内的有效降解率，使得处理后的全株玉米青贮向瘤胃微生物提供更多可溶性的营养成分[34]。瘤胃内环境作为一个相对繁琐的微生物系统，其中多种微生物和因素发挥着重要作用，需要继续深入研究来更好地掌握乳酸菌添加剂对反刍动物的益生菌效应[22]。

4 结论

本研究得到以下结论:1)玉米青贮中单独添加布氏乳杆菌可显著增加开窖60 d时DM、CP、Sta、NDF、ADF、WSC和EE含量。2)DMD、ADFD、NDFD、OMD随瘤胃降解时间的延长显著提高，瘤胃降解时间、不同试验处理以及其交互作用均极显著影响各指标变化。添加布氏乳杆菌显著提高DM和OM有效降解率，植物乳杆菌、戊糖片球菌和布氏乳杆菌复合添加显著提高NDF有效降解率。3)结合营养成分和有效降解率等12项参数指标综合评价各试验处理，最佳添加处理为单独添加布氏乳杆菌，添加量为1×105cfu·g-1。