燕麦与苜蓿不同比例组合对驴盲肠体外发酵的影响

2019-07-17梁婷玉郞侠吴建平王彩莲刘立山张瑞韦胜

草业学报 2019年6期

梁婷玉，郞侠，吴建平，*，王彩莲，刘立山，张瑞，韦胜

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州730070;2.甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所，甘肃兰州730070)

驴(Equus asinus)作为单胃草食动物，具有耐粗饲、抗逆性强等特性。我国养驴数在世界居首位，但目前国内尚没有专门饲养驴的营养标准，一般都根据小马营养需要量的75%来饲喂[1]。而相比于马，驴有更强的粗纤维消化能力，当按马的日粮配比饲喂驴时会出现一系列健康问题[2]。驴胃容积小，饲料在胃中停留时间短，是易饱又容易饿的动物，需采食大量低能量饲草来满足食欲，饲草中的纤维素能刺激胃肠蠕动进而促进营养物质的消化吸收。因此在驴的饲养管理中应结合其消化特性和生理需求供给充足的牧草。苜蓿(Medicago sativa)由于营养全面，蛋白含量高(20%以上)等特性，是草食家畜优质牧草之一[3]。研究发现，饲喂苜蓿干草可明显提高小马盲肠细菌总数，纤维分解菌的数目也显著增加，从而有利于纤维素降解[4-5]。在实践生产中，苜蓿不能单独饲喂家畜，其纤维含量低，缺乏可溶性碳水化合物，从而降低胃肠道微生物发酵[6]。研究表明，以秸秆等低质饲草作为家畜基础日粮时，苜蓿可作为理想补充料，可为瘤胃分解菌提供生长所必需的挥发性支链脂肪酸[7-8]。燕麦(Avena sativa)是仅次于小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)等粮食作物种植面积居世界第7的农作物，是我国唯一达到干草级的禾本科牧草。晾晒后的燕麦干草适口性好，养分含量高，中性洗涤纤维消化率高，且含有较多的水溶性碳水化合物，可为家畜提供充足的能量。研究发现燕麦干草代替部分苜蓿可改善断奶后犊牛瘤胃发酵，提高氮利用率，减少腹泻发生率[9]。

驴的盲肠有着与反刍动物瘤胃类似的作用，是纤维素被大量微生物发酵、分解、消化的地方[10]。Pearson等[11]研究发现饲喂稻草日粮时驴的表观消化率与牛相似。但饲喂任何单一牧草都不会使盲肠发酵达到优化，本研究通过体外发酵法来研究苜蓿与燕麦组合对驴盲肠降解率及其发酵参数组合效应的影响，为驴养殖业中饲草的科学利用提供数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用燕麦干草和苜蓿干草均采自甘肃省会宁县世民种养殖有限公司。饲草样品风干后粉碎，过0.425 mm，再在105℃下烘干至恒重后密封备用。饲草营养成分见表1。

1.2 盲肠液采集与处理

在甘肃省会宁县世民种养殖有限公司选2头3～4周岁、体重相近的成年驴作为盲肠液供体动物，屠宰后分离内脏，每头驴快速采集1.5 L盲肠液，用4层纱布过滤，装入提前预热至39℃的保温瓶中，同时持续注入CO2气体，快速带回实验室进行体外发酵试验。

表1 2种饲草常规营养成分(干物质基础)Table 1 Nutrient components of 2 kinds of forage grass(%DM basis)

1.3 试验设计

本试验以燕麦和苜蓿为发酵底物进行体外发酵，将燕麦与苜蓿按80∶20，60∶40，40∶60和20∶80进行组合，依次为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，各处理组设5个培养时间点，即2、4、8、12和24 h，每组每个培养时间点设3个重复，测定各培养时间点的产气量、发酵参数及养分降解率。

1.4 盲肠液体外发酵试验

1.4.1 人工唾液配制参照Menke[12]的方法配制人工唾液。其主要成分包含5部分(表2):微量元素溶液(A)、碳酸盐缓冲液(B)、常量元素溶液(C)、还原剂溶液(D)(现用现配)和指示剂(E)。在发酵试验开始前将各组分按以下比例混合配制缓冲液:依次加入蒸馏水400 m L、B液200 m L、C液200 m L、A液0.1 m L、D液40 m L和E液1 m L。在39℃恒温水浴锅中预热，并在充分混匀后持续通入CO2气体，直至溶液颜色由粉红色变为无色即可。

表2 人工唾液配方Table 2 The formula of artificial saliva

1.4.2 体外发酵及样品采集体外产气装置采用ANKOM RFS产气系统。准确称取按相应比例混合的饲草0.5 g装入250 m L厌氧发酵瓶底部，迅速向每个瓶中加入100 m L预热的液体培养基和50 m L经4层纱布过滤的盲肠液，并向瓶中持续通入CO25 s，立即盖上瓶塞，将每个发酵瓶与产气装置中相应的传感器相连接，于39℃下连续培养24 h。发酵过程中实时记录每小时的产气量(gas production，GP)。

发酵参数及养分降解率用人工瘤胃系统进行发酵。准确称取按相应比例混合的饲草0.5 g装入尼龙袋中，每组15个重复，在105℃下烘干至恒重后将4个处理组尼龙袋分别装入1、2、3、4号发酵罐，再向每个发酵罐中加入1000 m L缓冲液和500 m L经4层纱布过滤的盲肠液，并持续通入CO2气体10 s，盖上瓶盖放入人工瘤胃装置中进行发酵，在发酵过程中分别采集2、4、8、12和24 h时每组的发酵液45 m L分装于15 m L离心管-20℃保存待测，同时每组取3个尼龙袋，用自来水冲洗终止发酵，用于营养物质消化率测定。

1.5 测定指标及方法

1.5.1 常规营养成分分析及降解率测定参考袁缨[13]的《动物营养学实验教程》检测燕麦和苜蓿干物质(dry matter，DM)、粗脂肪(ether extract，EE)、粗蛋白(crude protein，CP)、粗灰分(crude ash，Ash)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)、钙(calcium，Ca)和磷(phosphorus，P)含量，计算燕麦与苜蓿不同比例组合DM、NDF和ADF体外降解率。其中:

某养分降解率=[(试验原料中某养分含量-发酵滤渣中某养分含量)/试验原料中某养分含量]×100%

1.5.2 发酵参数测定 1)p H及GP测定:采用p H5系列笔式p H计直接测定2、4、8、12、24 h时培养液的p H值。读取发酵2、4、8、12和24 h时的累积压力值，某时间点的累积产气量按下列公式计算:

Vx=Vj×Ppsi×0.068004084

式中:Vx为39℃下某时间点的产气体积(m L);Vj为发酵瓶内液面上部空间的体积(m L);Ppsi为软件记录的累积压力psi。

2)NH3-N、VFA及MCP浓度的测定:采用冯宗慈等[14]的方法测定培养液NH3-N浓度;采用GC-2010岛津气相色谱仪测定挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)含量;培养液中菌体蛋白(microbial protein，MCP)含量采用南京建成蛋白定量测试盒(A045-2)检测，即考马斯亮蓝法。

3)饲草组合效应的估算:

单组合效应指数(single-factor associative effects index，SFAEI)=(实测值-加权估算值)/加权估算值×100%

多项组合效应综合指数(multiple-factors associative effects index，MFAEI)=∑SFAEI=

SFAEIGP+SFAEIMCP+SFAEINH3-N+SFAEITVFA

式中:实测值为实际测定值;加权估算值=燕麦实测值×燕麦比例(%)+苜蓿实测值×苜蓿比例(%)。

1.6 数据统计分析

用Excel 2013整理后，用SPSS 21.0软件进行单因子方差分析，对营养物质降解率和发酵参数等数据用Duncan’s法进行多重比较，结果用平均值±标准误(Mean±SE)表示，当P＜0.05时认为差异显著;对组合效应值进行t检验。

2 结果与分析

2.1 饲草组合发酵液p H的变化

由表3可知，随着发酵时间的延长，各组p H均逐渐降低。在发酵2 h时，Ⅰ组p H最高，且显著高于Ⅳ组(P＜0.05);8 h时Ⅲ、Ⅳ组p H均显著高于Ⅰ和Ⅱ组(P＜0.05)，12 h时Ⅳ组p H显著高于Ⅰ和Ⅱ组(P＜0.05);24 h时Ⅳ组p H显著高于其余3组(P＜0.05)。

表3 饲草不同比例组合对驴盲肠体外发酵p H的影响Table 3 Effect of different proportions of forages on the p H of in vitro fermentation of donkey cecum

2.2 饲草不同比例组合对驴盲肠体外DM、NDF和ADF降解率的影响

由表4可知，随着发酵时间的延长，DM降解率逐渐增加。Ⅳ组各时间点DM降解率最高，发酵4 h时，Ⅳ组显著高于其余3组(P＜0.05)，12 h时Ⅳ组显著高于Ⅱ组(P＜0.05)，24 h时Ⅳ组显著高于Ⅰ组，其余各组间无显著性差异(P＞0.05)。

表4 饲草不同比例组合对驴盲肠体外DM消失率的影响Table 4 Effect of different proportions of forages on DM of in vitro fermentation of donkey cecum(%)

由表5可知，随着发酵时间的延长，NDF降解率逐渐增加，发酵2 h时Ⅰ、Ⅱ两组NDF降解率均显著高于Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)，从发酵8 h开始，Ⅳ组各时间点NDF降解率高于其他各组，但差异不显著(P＞0.05)。

表5 饲草不同比例组合对盲肠体外NDF消化率的影响Table 5 Effect of different proportions of forages on NDF of in vitro fermentation of donkey cecum(%)

由表6可知，随着发酵时间的延长，ADF降解率逐渐增加，发酵2 h时，各组间无显著性差异(P＞0.05);发酵4、8和12 h时，Ⅳ组ADF降解率显著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(P＜0.05);发酵24 h时Ⅳ组显著高于Ⅰ组(P＜0.05)，其余各组间无显著性差异(P＞0.05)。

表6 饲草不同比例组合对驴盲肠体外ADF降解率的影响Table 6 Effect of different proportions of forages on ADF of in vitro fermentation of donkey cecum(%)

2.3 饲草不同比例组合对驴盲肠体外发酵产气量(GP)的影响

由表7可知，各组产气量均随发酵时间的延长而不断增加，各时间点GP均为Ⅱ组显著高于其余3组(P＜0.05)，各组24 h GP由高到低依次为Ⅱ＞Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅲ，其中Ⅰ、Ⅲ组总产气量显著低于Ⅱ和Ⅳ组(P＜0.05)。

表7 饲草不同比例组合对驴盲肠体外发酵GP的影响Table 7 Effect of different proportions of forages on gas production of in vitro fermentation of donkey cecum(m L)

2.4 饲草不同比例组合对驴盲肠体外发酵NH 3-N浓度的影响

由表8可知，燕麦与苜蓿不同比例组合对驴盲肠体外发酵液中NH3-N浓度有显著影响。发酵2 h时，Ⅱ组NH3-N浓度显著高于其余3组(P＜0.05)，4 h时Ⅰ组显著高于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)，12和24 h时Ⅲ和Ⅳ组NH3-N浓度均显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P＜0.05)。

表8 饲草不同比例组合对驴盲肠体外发酵NH3-N浓度的影响Table 8 Effect of different proportions of forages on NH3-N concentration of in vitro fermentation of donkey cecum(mg·100 mL-1)

2.5 饲草不同比例组合对驴盲肠体外发酵MCP浓度的影响

由表9可知，随着发酵时间的延长，MCP浓度呈先降低再升高再降低的变化趋势，发酵2 h时Ⅳ组MCP浓度显著低于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组(P＜0.05)，12 h时Ⅲ、Ⅳ组MCP浓度显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P＜0.05)，24 h时Ⅱ组MCP浓度显著高于Ⅲ组(P＜0.05)，与Ⅰ、Ⅳ组间差异不显著(P＞0.05)。

表9 饲草不同比例组合对驴盲肠体外发酵MCP浓度的影响Table 9 Effect of different proportions of forages on MCP concentration of in vitro fermentation of donkey cecum(mg·mL-1)

2.6 饲草不同比例组合对驴盲肠体外发酵VFA的影响

燕麦与苜蓿不同比例组合对体外发酵液中VFA有较大影响(表10)。乙酸浓度在发酵2～12 h内，Ⅱ组均显著高于其他3组(P＜0.05)，24 h时Ⅰ、Ⅱ组间无显著性差异(P＞0.05)，但均显著高于Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)，且Ⅳ组显著高于Ⅲ组(P＜0.05);丙酸浓度在发酵2 h时Ⅱ组显著高于其他3组(P＜0.05)，4、8和12 h时Ⅰ、Ⅱ组间均无显著性差异(P＞0.05)，且在8和12 h时Ⅰ、Ⅱ组丙酸浓度均显著高于Ⅳ组(P＜0.05)，24 h时Ⅰ、Ⅳ组均显著高于Ⅱ和Ⅲ组;各组异丁酸浓度在各时间点均存在显著性差异，且Ⅱ组最高，在4、8和12 h时Ⅱ组显著高于其他3组(P＜0.05)，24 h时与Ⅰ组无显著性差异(P＞0.05);丁酸浓度在各发酵时间点均为Ⅱ组显著高于其他3组(P＜0.05)，24 h时Ⅰ组显著高于Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05);异戊酸浓度除发酵8 h时各组间差异不显著外(P＞0.05)，其他各时间点均为Ⅱ组显著高于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组(P＜0.05);戊酸浓度分别在2、4和12 h时Ⅱ组显著高于Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)，其余时间点各组间无显著性差异(P＞0.05);发酵2～12 h内各时间点总挥发性脂肪酸(TVFA)含量均是Ⅱ组显著高于Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)，24 h时Ⅰ、Ⅱ组间无显著性差异(P＞0.05)，但均显著高于Ⅲ和Ⅳ组，且Ⅲ组显著低于Ⅳ组(P＜0.05)。

表10 饲草不同比例组合对驴盲肠体外发酵VFA影响Table 10 Effect of different proportions of forages on VFA production of in vitro fermentation of donkey cecum(mmol·L-1)

2.7 饲草组合效应

由表11可知，单项组合效应值(SFAEI)中Ⅱ组的GP、TVFA和MCP效应值最高，Ⅳ组的NH3-N浓度效应值最高。但通过多项组合效应值(MFAEI)综合评估来看，Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ组均为正组合效应，且Ⅳ组组合效应值最高，Ⅲ组为负组合效应。

表11 燕麦与苜蓿组合效应综合评价Table 11 Comprehensive evaluation of combined effects of oat and alfalfa

3 讨论

3.1 燕麦与苜蓿不同比例组合对盲肠体外发酵液p H的影响

p H是维持盲肠内环境正常的重要指标之一，也是评价盲肠发酵的基本指标。p H的变化直接影响盲肠微生物对纤维类物质的降解[15]。细菌、原虫和厌氧性真菌最适生存p H分别为6.7、5.8和7.5[16]。本试验测得发酵液的p H为6.71～6.80，在盲肠微生物活动的适宜范围内，各比例组合的发酵环境稳定。试验结果显示在发酵2 h时随苜蓿含量的增加p H逐渐降低，从12 h开始，p H逐渐趋于稳定。有研究表明日粮中蛋白含量的增加可显著影响微生物发酵进而降低p H，但随着发酵时间的延长，发酵体系逐渐趋于稳定，p H逐渐趋于正常水平[17]，本试验结果与此一致。

3.2 燕麦与苜蓿不同比例组合对DM、NDF和ADF体外降解率的影响

日粮中DM的降解率是评价饲料被动物可利用程度的重要指标，一般DM降解率越高饲料的可利用程度越高[18]。NDF和ADF是粗饲料纤维物质的主要组成部分，具有调控微生物发酵作用[19]。本研究发现各组DM、NDF和ADF降解率随着发酵时间的延长，均呈不同程度的上升趋势，该结果与刘艳芳等[20]的研究结果一致。燕麦与苜蓿不同比例组合对NDF降解率无显著影响，对ADF降解率影响较为显著，但随着苜蓿比例增加DM、NDF和ADF降解率均有所升高。赵红艳[21]通过苜蓿与其他秸秆类饲草组合得出了相似结果。由于适宜的纤维含量会提高饲料利用率，但纤维含量过高会降低饲料利用率[22]。

3.3 燕麦与苜蓿不同比例组合对驴盲肠体外发酵产气量的影响

体外发酵产气量是衡量饲料可消化性的重要指标[23]。Silva等[24]发现不同粗饲料间组合可能会出现饲料间的正组合效应，改善劣质饲料的降解率，继而提高产气量。本试验结果表明，Ⅱ组各时间点累计产气量均为最高，Ⅱ和Ⅳ组产气量组合效应优于Ⅰ和Ⅲ组;此外Ⅱ组产气量显著高于Ⅳ组，该结果与汤少勋等[25]研究结果相似。有学者认为产气量的增加表明微生物发酵活性越强，则饲料消化率会不断提高[12，26]。但由于不同饲料的产气量并不相同，故产气量的多少并不能直接来评价饲料的降解程度，需要与其他指标相结合进行评价[27]。

3.4 燕麦与苜蓿不同比例组合对驴盲肠体外发酵NH 3-N和MCP浓度的影响

NH3-N浓度可反映日粮中蛋白的降解及MCP合成状况。有研究表明，瘤胃中NH3-N浓度为8.5 mg·100 m L-1时瘤胃微生物蛋白质合成能力将达到饱和[28]。本研究结果表明，发酵液中NH3-N浓度为2.73～5.94 mg·100 m L-1，且随着发酵时间的延长，发酵液中NH3-N浓度呈降低趋势，但随着苜蓿比例的增加，NH3-N浓度随发酵时间的延长而逐渐趋于稳定，Ⅱ组NH3-N浓度从2 h时的最高到24 h时降至最低，由此推断Ⅱ组微生物对NH3-N的利用较高。本试验所得NH3-N浓度与赵红艳[21]研究结果相比偏低，可能是由于本试验以单纯的粗饲料为发酵底物而使可降解碳水化合物偏少，进而使微生物活性受限所致[29]。有研究报道体外培养中满足微生物生长需要的理想NH3-N浓度为2～5 mg·100 m L-1[30]，因此本研究结果在正常范围内。MCP的代谢程度决定了消化道微生物区系的营养代谢水平[31]。MCP也反映饲料组合为微生物提供可利用蛋白质的能力，主要受饲料中可降解氮和可发酵能平衡程度的影响[32]。本研究结果显示在发酵12 h时苜蓿比例较高的Ⅲ和Ⅳ组MCP浓度较苜蓿比例低的Ⅰ和Ⅱ组高，但在24 h时Ⅱ组显著高于Ⅲ组，该结果与张锐等[33]的研究结果一致。

3.5 燕麦与苜蓿不同比例组合对驴盲肠体外发酵VFA的影响

饲粮经消化道微生物发酵所产生的乙酸、丙酸、丁酸等VFA是草食家畜主要的能量来源[34]。乙酸、丙酸和丁酸占消化道发酵TVFA的95%，其中乙酸是动物体合成乳脂肪和体脂肪的原料，丙酸主要是促进葡萄糖的转化与储存，丁酸可为动物机体供能[35]。试验中，燕麦与苜蓿不同比例组合对各种VFA及TVFA均有显著影响，其中在发酵24 h时，除丙酸外，Ⅱ组其余各种脂肪酸含量均显著高于其他3组;相比于苜蓿含量高的Ⅲ和Ⅳ组，Ⅰ和Ⅱ组TVFA含量显著提高。饲粮中可降解纤维含量的升高可提高发酵液中VFA的浓度，进而为消化道微生物生长繁殖提供充足能量[36-37]。

3.6 燕麦与苜蓿组合效应的综合评估

家畜采食混合饲料是绝对的，各营养素通过饲料间的相互作用和影响作用于家畜。Ewing等[38]将混合日粮中不同组分之间的相互影响定义为饲料组合效应。家畜品种、饲养水平、饲草料种类及配合比例等因素均可直接促使饲草料之间组合效应的发生[26]。单个饲料的营养价值及利用率会随着日粮结构和采食量等因素的不同而改变。本试验结果显示，燕麦与苜蓿不同比例组合，Ⅰ、Ⅱ两组SFAEI中24 h总产气量和TVFA为正，Ⅲ和Ⅳ组为负，且Ⅱ组大于Ⅳ组。从产气量、NH3-N、TVFA和MCP 4个指标综合分析发现Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ组MFAEI均为正，且Ⅳ组MFAEI值最大，Ⅲ组MFAEI为负。