L-精氨酸对大鼠胃肠激素分泌及食欲的影响

王超，康翠翠，冯江银，县怡涵，虞德夫，朱伟云，杭苏琴

(南京农业大学国家动物消化道国际联合研究中心，动物科技学院，江苏 南京210095)

氨基酸是构成蛋白质的基本物质，在生命活动的调节及维持内环境稳态中起重要作用。哺乳动物每天必须摄入一定量的氨基酸来满足机体需求，饲粮中氨基酸水平的变化会影响动物的食欲及动物生产性能。胃肠道是机体最大的内分泌器官，分布有多种内分泌细胞，包括胃G、D细胞及肠I、K、L细胞等[1]。在这些细胞上分布的营养感应体通过感应日粮中的营养物质，介导胃肠饱感激素分泌，通过脑肠轴调节胃肠道蠕动、胃酸分泌、血糖平衡以及饱腹感等生理反应[2]。

研究表明，钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSR)作为氨基酸感应体的一员，在人及大鼠的胃肠道内分泌细胞中广泛表达，不仅参与胃肠道营养素的吸收和代谢，同时可通过感应多种蛋白水解物如L-氨基酸、阳离子多肽等介导胃肠激素分泌而受到广泛关注[3]。Zhao等[4]报道，CaSR可介导L-色氨酸(L-Trp)刺激猪十二指肠分泌胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP)。Xian等[5]在猪胃上的研究发现，CaSR可介导L-Trp和L-苯丙氨酸(L-Phe)调控胃泌素(gastrin)和生长激素抑制素(somatostatin)分泌。此外，研究还发现，条件性必需氨基酸L-精氨酸(L-Arg)可通过CaSR促进大鼠小肠GIP、胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)等胃肠饱感激素分泌[6]。研究表明，这些胃肠饱感激素再通过血液或迷走神经作用于脑部与食欲调节相关的区域，调节下丘脑弓形核上的抑制采食的阿片促黑色素原(pro-opiomelanocortin，POMC)以及促进采食的神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)等的表达和机体的饱腹感[7]。上述很多研究都在体外进行，条件单一，而体内环境更复杂。因此，进一步研究氨基酸在体内对胃肠激素分泌、胃肠道CaSR基因表达及机体食欲的影响十分必要。Alamshah等[8]通过给小鼠回肠灌注L-Phe发现，小鼠采食量显著下降，血液中GLP-1和酪酪肽(peptide YY，PYY)的含量显著升高。当加入CaSR抑制剂后，小鼠采食量恢复正常。该研究表明，小鼠采食量下降可能是L-Phe通过CaSR诱导胃肠激素分泌引起的。Jordi等[9]通过给大鼠分别口服17种氨基酸发现，效果最显著的3种厌食性氨基酸分别是L-精氨酸、L-赖氨酸和L-谷氨酸。根据前人的研究，我们假设L-Arg可通过CaSR诱导胃肠激素分泌，影响大鼠采食。因此，本试验以大鼠为研究对象，通过给大鼠灌胃L-Arg，以探究其对大鼠胃肠道CaSR表达、胃肠激素分泌及采食的影响，为氨基酸调控机体采食的机制研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择体重为180～220 g的2月龄SD(SD大鼠，sprague-dawley rat)雄性大鼠32只。每只大鼠单笼饲养，鼠房温度20～25℃，保持12 h光照循环;自由采食饮水，提供啮齿动物标准颗粒料。饲养标准符合我国《实验动物管理条例》。大鼠及颗粒料均购自南京市青龙山动物繁殖中心。

1.2 试验设计及样品采集

1.2.1 试验I:灌胃不同浓度精氨酸对大鼠采食的影响 试验于2017年4月在南京农业大学动物实验基地进行。大鼠在室温下适应环境及日粮一周后，按照体重相近原则随机分为4个剂量组，每组8只。L-Arg·HCl低剂量组(5 mmol·kg-1)、中剂量组(10 mmol·kg-1)、高剂量组(20 mmol·kg-1)及对照组(0 mmol·kg-1)。进行灌胃时，左手将大鼠从笼中取出使大鼠呈直立状，头部后仰，嘴巴向上张开，右手拿起预先装有灌胃液的注射器，使灌胃针顺着大鼠上颌部向内伸入食道，将灌胃液注入食道使其进入胃部。大鼠灌胃前禁食12 h(6:00-18:00)，每只大鼠灌胃总体积为2.5 m L。灌胃结束后，饲喂预先称量好的标准颗粒料，记录并计算灌胃后0～1 h、1～2 h、2～4 h及0～24 h内大鼠的采食量。根据采食量结果筛选出对大鼠采食影响显著的L-Arg最适剂量，用于大鼠一周灌胃试验。L-Arg·HCl购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2.2 试验II:灌胃精氨酸一周对大鼠胃肠激素分泌、CaSR基因表达、采食量及体重的影响 另选30只雄性大鼠适应环境一周，按照体重相近原则随机分为2组，L-Arg·HCl高剂量组(20 mmol·kg-1)及对照组(0 mmol·kg-1)，灌胃大鼠一周(每天一次)。在此期间，记录大鼠初始体重、终体重并计算体重变化，每天记录采食量。一周后眼球静脉采血，血液凝固后以3500 r·min-1离心10 min取上层血清，-20℃冷冻保存，用于胃泌素(gastrin)、胆囊收缩素(CCK)、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的检测。采血后脊椎脱臼处死，立即打开腹腔取出胃肠道，根据解剖学区分部分组织，冰上剪取胃、十二指肠、空肠及回肠中段组织，磷酸盐缓冲液 (phosphate buffered saline，PBS)漂去肠内容物;打开头骨，采集下丘脑，所有组织剪碎置于液氮保存，检测胃肠道CaSR及下丘脑厌食因子POMC及促食因子NPY(神经肽Y，neuropeptide Y)的基因表达。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 血清胃肠激素含量的测定 严格按照大鼠Gastrin、CCK、GIP及GLP-1的试剂盒说明书利用酶标仪(infiniteF50，TECAN，瑞士)检测大鼠血清中的胃肠激素含量。大鼠Gastrin(型号:ANG-E12225R-1，检测范围:2～50 ng·L-1，板内差异＜9%，板间差异＜15%)，CCK(型号:ANG-E11530R-1，检测范围:10～200 ng·L-1，板内差异＜9%，板间差异＜15%)，GIP(型号:ANG-E11427R-1，检测范围:80～2400 pg·m L-1，板内差异＜9%，板间差异＜15%)，及GLP-1(型号ANG-E11115R-1，检测范围:0.2～4.0 pmol·L-1，板内差异＜9%，板间差异＜15%)，试剂盒均购自南京奥青生物技术有限公司。

1.3.2 总RNA的提取、反转录及实时荧光定量PCR

根据RNA快速提取试剂盒(RNApure Total RNA Kit，RN03，北京艾德莱生物科技有限公司)说明书提取大鼠胃、十二指肠、空肠、回肠及下丘脑的总RNA，反转录体系及反应条件严格按照反转录试剂盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser，RR047A，大连宝生物工程有限公司)操作说明进行。

根据参考文献[10-12]中大鼠CaSR、POMC、NPY以及GAPDH序列合成引物，引物信息见表1。以cDNA为模板，采用SYBR GreenⅡ染料试剂盒(SYBR®Premix Ex TaqTM，RR420A，大连宝生物工程有限公司)在Step OnePlus 2.2.2(Life Techhnologies，美国)上进行实时荧光定量PCR。反应体系包括:SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus)(2×)10μL，上、下游引物各0.4μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板2μL，dd H2O 6.8μL。PCR反应程序为:95℃预变性30 s;95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，40 cycles;95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。每个样品3个重复，采用2-△△Ct法计算各基因的相对表达量。

表1 相关基因的引物序列Table 1 Primer sequences of related genes

1.4 数据统计分析

采用SPSS 20.0(IBM公司，美国)统计软件进行统计学分析，各检测指标结果以平均值±标准误表示。单因素方差模型One-way ANOVA分析试验I结果，S-N-K test检验差异显著性;独立样本t检验分析试验II结果，F-test检验方差同质性。P＜0.05为差异显著。Pearson模型分析血清中胃肠激素浓度与胃肠道CaSR及下丘脑POMC、NPY基因表达的相关性，相关系数用R表示，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 灌胃精氨酸对大鼠采食量及体重的影响

从图1A可以看出，与对照组相比，灌胃10及20 mmol·kg-1L-Arg·HCl后0～1 h内，大鼠的采食量分别下降了46.0% 和60.9%(P＜0.05);在1～2 h及2～4 h内，各组之间无显著差异;在0～24 h内，分别下降了16.0%和23.1%。说明灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl溶液对大鼠采食量的影响显著。

根据上述结果，接下来给大鼠灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl一周，初步探究精氨酸对采食的影响是否长期存在，最终是否影响大鼠体重。结果如图1B所示，与对照组相比，20 mmol·kg-1L-Arg·HCl显著降低了大鼠0～1 d和0～2 d的累加采食量(P＜0.05)，0～7 d的采食量有降低的趋势。大鼠体重变化如图1C所示，与对照组相比，20 mmol·kg-1L-Arg·HCl显著降低了大鼠体增重(P＜0.05)。

图1 灌胃不同浓度精氨酸对大鼠0～24 h内采食量(A)及灌胃精氨酸一周对大鼠采食量(B)和体重(C)的影响Fig.1 Effect of oral gavage of different concentrations of L-Arg·HCl on feed intake of 0-24 h in rats(A)and effect of oral gavage 1 week of 20 mmol·kg-1 L-Arg·HCl on feed intake(B)and body weight(C)in rats

2.2 灌胃精氨酸对大鼠血清胃肠激素的影响

从图2可以看出，与对照组相比，灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl一周，血液中CCK的浓度显著升高(P＜0.05);Gastrin和GIP的浓度有升高的趋势(P=0.06);而GLP-1的浓度没有显著变化。

2.3 灌胃精氨酸对大鼠胃及小肠CaSR表达的影响

如图3所示，与对照组相比，灌胃20 mmol·kg-1的L-Arg·HCl显著提高大鼠胃、十二指肠、空肠及回肠中CaSR的基因表达水平(P＜0.05)。说明，精氨酸可以激活分布于胃及小肠上的CaSR。

2.4 灌胃精氨酸对大鼠下丘脑食欲调节因子基因表达的影响

结果如图4所示，与对照组相比，灌胃20 mmol·kg-1L-Arg·HCl一周后，POMC基因相对表达量显著升高(P＜0.05)，NPY无显著差异(P＞0.05)。表明L-Arg可能是通过促进厌食因子的表达，进而下调大鼠采食量。

图2 灌胃精氨酸对大鼠胃肠激素分泌的影响Fig.2 Effect of oral gavage of L-Arg·HCl on the gut hormone secretion in rats

图3 灌胃精氨酸对大鼠胃及小肠CaSR表达的影响Fig.3 Effect of oral gavage of L-Arg·HCl on mRNA expression of CaSR in the stomach and small intestine of rats

图4 灌胃精氨酸对大鼠下丘脑食欲调节因子POMC和NPY基因表达的影响Fig.4 Effect of oral gavage of L-Arg·HCl on mRNA expression of POMC and NPY in the hypothalamic neurons of the rats

2.5 大鼠胃肠激素与胃肠道CaSR及下丘脑POMC和NPY基因表达的相关性分析

由表2可以看出，血清Gastrin浓度与胃中CaSR基因表达量呈显著正相关(P＜0.05)，与下丘脑食欲调节因子POMC、NPY无显著相关性(P＞0.05);CCK浓度与十二指肠、空肠CaSR及下丘脑POMC基因表达量呈显著正相关(P＜0.05);GIP浓度与十二指肠CaSR及下丘脑POMC基因表达量呈显著正相关(P＜0.05);GLP-1浓度与空肠CaSR及下丘脑POMC基因表达量有正相关的趋势(0.05＜P＜0.1)。

表2 大鼠血清胃肠激素与胃肠道CaSR及下丘脑POMC和NPY基因表达的相关性分析Table 2 Correlation of the concentration of gut hormone in serum with the gene expression level of CaSR in gastrointestinal tract and POMC,NPY in hypothalamus of rats

3 讨论

3.1 灌胃精氨酸对大鼠采食量及体重的影响

蛋白质为动物生长提供了重要的能源物质，然而有研究发现，长期高蛋白饮食会促进机体产生饱腹感并导致体重下降[13]。Veldhorst等[14]研究发现，蛋白质引起的饱腹感主要与其在胃肠道水解产生的氨基酸及小肽有关。Jordi等[9]发现，给大鼠灌胃6.7 mmol·kg-1L-Arg溶液显著降低了大鼠采食量;Greenwood[15]给小鼠腹腔注射4 mmol·kg-1L-Arg显著降低小鼠采食量;当给大鼠灌胃4 mmol·kg-1L-Arg溶液，大鼠采食量在0～1 h内有下降的趋势但不显著。说明，一定剂量的精氨酸与采食有关。本研究结果显示，5 mmol·kg-1的L-Arg·HCl溶液对大鼠采食没有影响，10 mmol·kg-1以上的浓度显著降低大鼠的采食量，且采食量的降低与L-Arg·HCl的浓度存在线性剂量依赖效应。而且，大鼠在灌胃后1 h采食量下降显著，在1～2 h和2～4 h内各组间的采食量没有显著差异。Alamshah等[8]给大鼠灌胃L-Phe同样发现，大鼠在0～1 h内采食量下降最显著。说明氨基酸对采食量的影响可能与胃肠饱感激素对机体采食的调节有关，饱感激素主要在短期内显著分泌并发挥作用，其浓度可在分泌后几十分钟内显著降低[16]，从而导致采食量在0～1 h下降最显著。此外，本试验灌胃一周L-Arg·HCl显著降低大鼠体增重及0～2 d的累加采食量，0～7 d的累加采食量呈下降趋势，表明大鼠体增重的减少与采食量的降低有关。Clemmensen等[17]研究发现，给小鼠长期补充L-Arg会减少白色脂肪组织的增加，表明大鼠体增重的减少还可能与白色脂肪组织的减少有关，其具体的影响机制需要进一步的深入研究。

3.2 灌胃精氨酸对大鼠胃肠道CaSR基因表达及胃肠激素分泌的影响

CaSR作为胃肠道重要的氨基酸感应体，在感应蛋白水解物以及介导胃肠激素分泌中起着重要的作用。赵秀英等[18]研究发现降低日粮蛋白水平后，猪小肠CaSR基因表达下降，并伴随着血清中CCK、GIP、GLP-1等胃肠激素含量的降低。与上述结果相似，本研究结果显示，大鼠灌胃L-Arg显著提高了胃和小肠中CaSR基因的表达，促进了Gastrin、CCK和GIP的分泌。有研究报道，CaSR在胃肠道中的G、I、K及L细胞等内分泌细胞中均有表达[3]。本试验相关性分析发现，胃中CaSR的表达与血液中Gastrin的含量呈显著正相关，十二指肠和空肠中CaSR表达与CCK的浓度呈显著正相关，十二指肠CaSR表达与血液中GIP浓度呈显著正相关，这可能与Gastrin主要由胃窦G细胞分泌，CCK主要由存在于十二指肠和空肠的I细胞分泌，GIP主要由存在于近端小肠的K细胞分泌有关[19]。前期的体外研究结果显示，当用L-Arg对猪十二指肠进行灌流时，可显著促进CCK、GIP分泌;然而当加入CaSR抑制剂NPS 2143后，氨基酸引起的激素促分泌作用消失[20]。以上结果说明L-Arg引起的胃肠激素分泌可能是CaSR介导引起的。本试验还发现，GLP-1的分泌无显著变化，然而有研究发现，L-Arg可以诱导小鼠体内或离体L细胞GLP-1的分泌[21];另有研究表明，肠道感应营养物质后15～30 min出现GLP-1瞬时分泌高峰，在60～90 min再次达到高峰[22]。本试验中GLP-1分泌无显著变化可能是由于本试验在灌胃后30 min采集血液，因而未检测到GLP-1的分泌高峰。

3.3 灌胃精氨酸对大鼠下丘脑食欲调节因子的影响

食欲调节系统包括外周及中枢神经系统，下丘脑作为食欲调节中枢在机体采食中起重要调节作用。Sam等[23]报道，内分泌细胞分泌的激素可以通过血脑屏障到达下丘脑，与下丘脑中相关激素受体相结合，传递促/厌食信号;或者通过与迷走神经上的激素受体相结合将促/厌食信号传达至下丘脑弓状核或脑干，激活摄食相关因子如厌食因子POMC、安非他明调节转录因子(cocaine and amphetamine regulated transcript，CART)和促食相关因子NPY及野鼠相关肽(agouti gene-related protein，AgRP)，从而激活室旁核和外侧下丘脑区域的肾上腺皮质素受体3和4，调控机体采食量。本试验对NPY和POMC的基因表达进行检测，结果发现，厌食因子POMC的表达量显著升高，NPY没有显著变化;且相关性分析表明CCK及GIP的浓度与POMC基因表达量呈显著正相关。这可能是由于L-Arg刺激饱感激素分泌后，激素与下丘脑激素受体结合或通过与迷走神经激素受体结合后将厌食信号传递至下丘脑，下丘脑接收信号后激活厌食因子POMC，从而使POMC基因表达上调。隋啸一等[24]给家兔饲喂高蛋白日粮发现，十二指肠中CCK及下丘脑弓形核中厌食因子CART和POMC的基因表达显著升高。Fan等[25]在小鼠上研究发现，CCK可通过调节下丘脑POMC神经元降低小鼠的采食。本研究中胃肠激素CCK显著分泌，伴随着POMC表达量的显著升高，与以上研究结果一致，进一步说明饱感激素CCK与下丘脑厌食因子POMC存在一定关系。然而饱感激素与下丘脑食欲调节因子之间的直接关系尚需进一步验证。有研究表明，NPY作为促进食欲调节的重要神经元，其表达量会随着机体对能量需求的增强而升高[26]，在本试验中大鼠可随时获取食物，没有产生明显饥饿感，这可能导致了灌胃精氨酸没有显著影响大鼠NPY基因的表达。

4 结论

灌胃20 mmol·kg-1L-Arg显著降低了大鼠采食量及体增重，促进CCK等胃肠激素的分泌，提高了胃和小肠中CaSR及下丘脑厌食因子POMC的基因表达。相关性分析结果表明，灌胃L-Arg后，大鼠血液中Gastrin浓度与胃中CaSR基因表达呈显著正相关，CCK浓度与十二指肠、空肠CaSR、下丘脑POMC基因表达呈显著正相关，GIP浓度与十二指肠CaSR和下丘脑POMC基因表达呈显著正相关。