响应面优化黄槿叶总黄酮提取工艺及其抗氧化活性

陈建福

（漳州职业技术学院食品工程学院，福建 漳州 363000）

黄槿（Hibiscus tiliaceus），又名公背树、黄木槿、海麻和桐花等，是锦葵科木槿属植物，生长在沿海岸或潮水能到达的河岸上[1-2]。黄槿生长速度快、耐热、耐旱、耐瘠、抗风、耐碱、萌芽强、易移植，适于海岸地带绿化美化，为海岸防沙、防潮、防风之优良树种，在我国的福建、台湾、广西、海南、广东等沿海省区均有分布[3]。黄槿的叶、花和树皮均可入药，是《全国中草药汇编》收录的药用植物之一。黄槿叶含有黄酮、多糖和多酚等多种天然有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌等活性[4-5]。黄酮是一类广泛存在于植物体中含有C6-C3-C6基本框架的一类天然产物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、保护心脑血管、抗细菌、抗抑郁及镇痛等生理活性，已广泛应用于食品、医药和保健等领域中[6-8]。本文以漳州产黄槿叶为原料，对其中的总黄酮进行提取，利用响应面法进行优化得到了最佳的提取工艺，并考察了总黄酮对DPPH 自由基的清除作用，为黄槿叶总黄酮的工业化提取奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄槿叶，采于漳州职业技术学院校内，经漳州职业技术学院食品工程学院园艺学专业王水琦教授鉴定为锦葵科黄槿叶；芦丁标准品：上海沪宇生物试剂公司；2，6-二叔丁基对苯酚（2，6-di-tert-butyl-pcresol，BHT）：国药集团上海化学试剂有限公司；抗坏血酸（VC）：西陇化工股份有限公司；其它试剂均为分析纯。

UV-7504 型紫外可见分光光度计：上海精密仪器仪表有限公司；FW-100 高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；RE-52A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；AR124CN 电子天平：奥豪斯仪器上海有限公司；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 总黄酮含量的测定

根据文献[9]方法采用NaNO2-Al（NO3）3比色法，以芦丁为标准品绘制标准曲线并线性回归得方程。准确量取一定量提取完后的提取液定容于10 mL 容量瓶中，并按文献方法测出吸光度，代入回归方程得出总黄酮质量浓度b，通过式（1）计算得总黄酮的提取率。

式中：b 为总黄酮质量浓度，mg/L；V 为提取液体积，mL；m 为黄槿叶的质量，g。

1.2.2 黄槿叶总黄酮的提取

将采摘的黄槿叶浸泡于蒸馏水，洗净，自然晾干，并于50 ℃的鼓风干燥箱中干燥，粉碎，取60 目～80 目之间的粉末，备用。称取1.00 g 的黄槿叶粉末装入100 mL 的圆底烧瓶中，置于水浴锅中按提取工艺进行提取，提取结束后，按1.2.1 计算得总黄酮提取率。

1.2.3 单因素试验

以乙醇浓度 60%、液料比 30∶1（mL/g）、提取温度80 ℃和提取时间100 min 为固定水平，考察各单因素对黄槿叶总黄酮提取率的影响，以确定响应面实验的工艺参数范围。各因素分别设置5 个水平，具体为乙醇浓度 40%、50%、60%、70%、80%，液料比 20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1（mL/g），提取温度 70、75、80、85、90 ℃，提取时间 80、90、100、110、120 min，每组试验重复3 次，取均值。

1.3 响应面设计

通过单因素的试验结果对影响黄槿叶总黄酮提取率的乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取温度（C）和提取时间（D）4 个因素进行Box-Behnken 试验设计。具体因素编码与水平见表1。

表1 Box-Behnken 设计因素与水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度的影响

乙醇浓度对提取率的影响见图1。

图1 乙醇浓度的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration

由图1可知，当乙醇浓度在40%～60%时，乙醇浓度增大，总黄酮提取率也增大，这是因为乙醇浓度与黄槿叶总黄酮的极性有关，当二者极性接近时，有利于总黄酮溶解到溶剂中，使得提取率增大，但当乙醇浓度过大时，溶剂的极性过小，反而使得总黄酮的提取率下降[10]，因而乙醇浓度选择为60%。

2.1.2 液料比的影响

液料比对提取率的影响见图2。

由图2可知，当液料比在 20∶1（mL/g）～30∶1（mL/g）时，液料比增大，总黄酮提取率也增大，这是因为料液比的增大，增强了溶剂对总黄酮的绝对溶解能力，提高了总黄酮的提取率，但当液料比过大时，溶剂溶解的叶绿素等其它化合物增加[11]，这些物质会与总黄酮产生溶出竞争，造成总黄酮提取率的下降，因而液料比选择为 30∶1（mL/g）。

2.1.3 提取温度的影响

提取温度对提取率的影响见图3。

图2 液料比的影响Fig.2 Effects of liquid to solid ratio

图3 提取温度的影响Fig.3 Effects of extraction temperature

由图3可知，当提取温度在70 ℃～80 ℃时，提取温度升高，总黄酮提取率也增大，这是因为提取温度的升高，促进了总黄酮分子从黄槿叶颗粒中到溶剂的渗透能力，使得总黄酮的提取率增加，但当提取温度过高时，黄槿叶总黄酮中的热不稳定性成份容易发生破坏[12]，造成总黄酮提取率的下降，因而提取温度选择为80 ℃。

2.1.4 提取时间的影响

提取时间对提取率的影响见图4。

由图4可知，当提取时间在80 min～100 min 时，随着提取时间的延长，总黄酮提取率也增大，这是因为提取时间的延长，增加了溶剂与黄槿叶颗粒之间的渗透时间[13]，使得总黄酮提取率增大，但当提取时间过长时，在长时间的提取加热体系中会有部分总黄酮因氧化而降解，造成总黄酮提取率的下降，因而提取时间选择为100 min。

图4 提取时间的影响Fig.4 Effects of extraction time

2.2 Box-Behnken试验设计与方差分析

2.2.1 响应面试验

Box-Behnken 试验设计有24 个析因试验和5 个中心点试验共29 个试验见表2，方差分析结果见表3。

表2 Box-Behnken 设计与试验结果Table 2 Box-Behnken design and experiment results

表3 回归模型方差分析表Table 3 Table of regression model variance analysis

2.2.2 模型的建立与分析

对表2中的Box-Behnken 试验结果进行响应面分析，得到黄槿叶总黄酮提取率响应值（Y）与乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取温度（C）和提取时间（D）4 个所考察因素的二次多项式回归模型：

Y=28.29+0.20A+0.07B-0.39C-0.11D-0.30AB-0.16AC-0.29AD+0.69BC+0.49BD+0.81CD-0.81A2-0.75B2-0.97C2-0.82D2

二次多项式回归模型的方差分析可知，F=10.99，p＜0.000 1，回归模型极为显著，说明黄槿叶总黄酮提取率与所考察的工艺因素之间的关系可以利用该回归方程来正确反映。失拟项p=0.233 6＞0.05，不显著，表明二次多项式回归模型与试验值拟合较好。模型的相关系数R2为0.916 6，表明试验值与预测值之间有较好相关性，有91.66%的试验值能够利用预测值来解释。由表3可知，一次项 C，二次项 A2、B2、C2、D2对黄槿叶总黄酮提取率影响达到极显著水平（p＜0.01），液料比和提取温度的交互项BC，提取温度和提取时间的交互项CD 对黄槿叶总黄酮提取率影响极显著（p＜0.01），其 P 值分为别 0.002 1 和 0.000 5；液料比和提取时间的交互项BD 对黄槿叶总黄酮提取率影响显著（p＜0.05），一次项 A、B、D，交互项 AB、AC、AD 对黄槿叶总黄酮提取率影响不显著（p＞0.05），说明所考察的4 个因素乙醇浓度、液料比、提取温度和提取时间与黄槿叶总黄酮提取率之间不是简单的线性关系。

2.2.3 响应面分析

因素间交互作用对总黄酮提取率的影响见图5。

通过响应面和等高线图可以分析所考察的乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取温度（C）和提取时间（D）4个工艺因素之间交互作用对总黄酮提取率的影响。如果所考察的两因素交互作用的响应面坡面较为陡峭，表明该响应值对于交互作用的变动很敏感，交互作用对于响应值影响较为显著，相反如果响应面坡面较为平缓，则表明响应值对于交互作用的变动影响较小，交互作用对响应值影响较不显著。从图5可知，响应面图曲线最陡的是提取温度和提取时间交互作用图，说明所考察的因素中交互作用对黄槿叶总黄酮提取率的影响最为显著是提取温度和提取时间，响应面曲线相对较陡的是液料比和提取温度交互作用图，说明所考察的因素中交互作用对黄槿叶总黄酮提取率的影响显著程度次之的是液料比和提取温度，同理可得，各因素交互作用对黄槿叶总黄酮提取率的影响顺序为 CD＞BC＞BD＞AB＞AD＞AC。

图5 因素间交互作用对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of interactions factors on extraction yield of total flavonoids

2.2.4 最优化试验验证

对回归模型进行分析得到黄槿叶总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度 64.16%、液料比 27.04∶1（mL/g）、提取温度76.38 ℃和提取时间93.28 min。在此最佳条件下，预测黄槿叶总黄酮的提取率为28.48 mg/g。为了方便实际的工艺参数设定，将最佳提取工艺条件修正为乙醇浓度 64 %、液料比 27∶1（mL/g）、提取温度76 ℃和提取时间93 min，在修正后，进行3 次平行试验，测得黄槿叶总黄酮提取率为28.35 mg/g，与理论值（28.48 mg/g）相差为0.46%，说明利用该方程对黄槿叶总黄酮的提取率进行优化与预测具有较高的准确性和可靠性。

2.3 黄槿叶总黄酮的抗氧化活性

DPPH 自由基清除能力见图6。

图6 DPPH 自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging ability

从图6可知，在10 mg/L～70 mg/L 浓度范围内，随着浓度的增大，BHT、VC和黄槿叶总黄酮对DPPH 自由基的清除能力均增强，其IC50分别为44.02、51.72、57.76 mg/L，黄槿叶总黄酮对DPPH 自由基的清除能力低于BHT 及VC，但当浓度大于70 mg/L 后，黄槿叶总黄酮对DPPH 自由基的清除能力开始高于VC，说明黄槿叶总黄酮具有较强的抗氧化活性。

3 结论

利用Box-Behnken 方法对影响黄槿叶总黄酮提取率的4 个因素进行了响应面设计并进行优化，得到了二次多项式回归模型。黄槿叶总黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇浓度 64%、液料比 27∶1（mL/g）、提取温度76 ℃和提取时间93 min，在该条件下测得黄槿叶总黄酮提取率为28.35 mg/g，与理论值（28.48 mg/g）相差为0.46%，说明利用该方程对黄槿叶总黄酮的提取率进行优化与预测具有准确性和可靠性，所提取的黄槿叶总黄酮具有较强的抗氧化活性，对DPPH 自由基的清除能力的IC50为57.76 mg/L。