角蛋白酶体外酶解豆粕的营养价值及其在断奶仔猪生产中的应用研究

于海涛，周智旋，耿正颖，陆文清

（中国农业大学动物科学技术学院，农业农村部饲料工业中心，北京 100193）

豆粕是目前应用最广泛的植物蛋白饲料原料，其具有粗蛋白质含量高、氨基酸平衡等特点，能够满足动物体的蛋白质需要[1]。然而，豆粕中的蛋白质主要为β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白[2]，降低了豆粕的营养价值。目前，许多研究已经将蛋白酶作为降解大豆蛋白的重要手段，但最近一项研究表明，蛋白酶对大豆蛋白的体外降解并不总是降低其生物学的致敏性[3]，这意味着大豆蛋白的降解是具有蛋白酶特异性。

角蛋白酶因能降解角蛋白和高角蛋白含量的生物质（如动物毛发）而得名[4]。角蛋白酶体外酶解豆粕逐渐转变为生产低抗营养因子（β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白）豆粕的解决方案[5]。目前，角蛋白酶作为饲料添加剂在家禽和生长猪上的饲养效果也已经得到验证。Wang 等[6]试验表明，在日粮中添加0.05%的角蛋白酶能够提高生长猪的日增重，改善其饲料转化效率。Odetallah 等[7]研究表明，在玉米-豆粕型肉仔鸡日粮中加入0.10%的角蛋白酶（薄膜超滤，冻干）能够提高肉仔鸡的生长性能，在较低蛋白水平的日粮中作用更明显。陈乃松等[8]研究表明，低抗原大豆蛋白能够替代水产料中的部分鱼粉。近年来，角蛋白酶在仔猪上的应用研究也越来越受到关注[9-10]，但角蛋白酶促进动物生长性能的作用机制尚未明确，而豆粕是否可作为角蛋白酶的作用底物，是否因角蛋白酶降解了豆粕中的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白而降低仔猪的腹泻率以及促进仔猪生长也尚不清楚。本试验拟在豆粕中混入小麦麸共同作为辅料，测定角蛋白酶体外酶解后物料的营养物质组成，进一步探究饲粮添加酶解豆粕对断奶仔猪生长性能、腹泻率和粪便指标的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料 耐高温角蛋白酶赛和素®DP100（CIBENZA®DP100）由诺伟司（Novus）国际贸易（上海）有限公司提供。去皮豆粕（中国饲料号5-10-0103，去皮，浸提或预压浸提）购自天津中粮佳悦有限公司。小麦麸购自北京益海嘉里粮油食品工业有限公司。呼吸袋（规格：20 kg 底物规模）购自北京晟亚育达生物科技有限公司。

1.2 酶解豆粕的制备 试验在北京市平谷区的实验基地进行，正值春季，车间平均温度为25℃，整体环境适宜制备酶解豆粕。出于干燥工艺上的考虑，制备角蛋白酶酶解豆粕时添加了小麦麸，以达到提升物料流散性，减少干燥后物料结块的目的。原料包括：140 kg 豆粕、60 kg 小麦麸、160 L 自来水和1.2 kg 角蛋白酶。物料混匀后平均分装于塑料桶中，压实后加盖密封。酶解过程中实时监控室内环境温湿度、物料中心温度和物料pH 的变化。其中，温湿度采用温湿度自动记录仪进行记录，每15 min 记录1 次温湿度；物料中心温度为选取其中的一桶物料进行定点定时观测，每20 min 记录1 次温度；物料pH 采用工业级的便携式pH 计和探头对每桶物料pH 进行不定时观测。

1.3 试验动物及饲养 管理 本试验选用平均体重为（8.29±0.51）kg 的72 头23 日龄断奶、健康的杜×长×大断奶仔猪，进行为期28 d 的饲养试验。试验于国家饲料工程技术研究中心/农业部饲料工业中心动物试验基地（河北丰宁）进行。断奶仔猪保育舍内温度、湿度、通风强度、CO2和氨浓度自动化控制，试验期间保育舍温度维持在25～28℃。夜间加强畜舍保暖，试验期前7 d 采用暖灯供暖。断奶仔猪为分栏饲养，饲养于1.5 m×1.5 m 的圈内，配有漏缝喷塑地板、不锈钢可调式料槽和鸭嘴式饮水器，以粉料饲喂，自由采食和饮水。

1.4 试验设计与饲粮 将72 头断奶仔猪按体重和性别进行完全随机区组，设2 个处理，每个处理6 个重复，每个重复6 头。对照组为玉米-豆粕型基础饲粮，酶解豆粕组日粮含12.90%豆粕和12.50%豆粕麦麸混合型酶解豆粕。营养水平不低于NRC[11]生长猪营养需要量推荐值，其组成和营养成分见表1。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 饲料和试验饲粮营养物质组成及抗营养因子检测豆粕、麦麸、酶解豆粕以及试验饲粮的干物质（DM）、粗蛋白质（CP）中性洗涤纤维（NDF）测定分别《饲料中干物质的测定》（GB/T 6435-2014）、《饲料中粗蛋白质的测定》（GB/T 6432-1994）、《饲料中中性洗涤纤维的测定》（GB/T 20806-2006），酸性洗涤纤维（ADF）测定按照《饲料酸性洗涤纤维的测定方法》（NY/T 1459-2007）。总能（GE）按照国际标准ISO9831:1998 方法，使用氧弹氏测热测定仪测定。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量采用大豆抗原蛋白ELISA 测定试剂盒（北京龙科方舟生物工程技术有限公司，北京）测定，相关溶液配制及操作依试剂盒说明书进行。酶解豆粕的蛋白分子量分布采用Tricine-SDSPAGE 蛋白凝胶电泳进行检测。寡糖含量和挥发性脂肪酸含量测定采用离子色谱（ICS 3000；Thermo）。

15 种氨基酸按照《饲料中氨基酸的测定》（GB/T 18246-2000）测定。样品在110℃条件下6 mol/L HCl水解24 h 后使用氨基酸自动分析仪（L-8900）测定。含硫氨基酸按照《饲料中含硫氨基酸测定方法》（GB/T 15399-94）测定，样品在0℃下过钾酸氧化16 h，在经HCl 水解24 h 后使用氨基酸自动分析仪测定。色氨酸按照《饲料中氨基酸的测定》（GB/T 18246-2000）测定，样品用4 mol/L 氢氧化钠在110℃条件下水解22 h 后，使用高效液相色谱仪（Agilent 1260）测定。

表 1 试验饲粮原料和营养成分（饲喂基础） %

1.5.2 生长性能 试验第0、14、28 天早晨对每头仔猪进行逐一称重，称重前一晚结料称重，计算平均日增重（ADG）；以重复（圈）为单位记录耗料量，试验第14、28 天结料称重，计算平均日采食量（ADFI）；以重复（圈）为单位，计算饲料转化率（FCR）。计算公式：

ADG（g）=（平均末重-平均初始重）/天数

ADFI（g）=（每天投料量-次日剩料量）/该重复当天猪数

FCR = ADFI/ADG

1.5.3 腹泻率与粪便评分 从试验期开始，每天08:00观察仔猪的腹泻状况，及时记录。仔猪是否腹泻主要以观察动物个体行为状态（如尾部沾染湿粪便、拉稀、肛门红肿和脱水等外在表征）与圈舍漏粪板上的稀便痕迹为主。计算公式：

腹泻率=腹泻仔猪数/现存仔猪数×100%

试验期间，每天进行粪便评分。粪便评分标准参照Pierce 等[12]所使用的方法，即：硬便，1 分；轻微软便，2 分；部分成型的软便，3 分；松散、半液体的粪便，4分；水样粘液型粪便，5 分。若粪便评分为4 或5，则认为该头猪腹泻。

1.6 统计分析 各处理组腹泻率之间的差异性分析采用卡方检验。其他数据采用SAS 9.2 的GLM 模型中的t-test方法进行统计分析，所有数据以重复为统计单位，若各处理组间差异显著，则用Duncan´s 多重比较进行检验。统计结果用平均值以及标准误来表示，P＜0.05 表示差异显著，0.05＜P＜0.1 为有趋势。统计数据的可视化采用GraphPad Prism 5.01 软件，图像处理采用Adobe Photoshop CS4 软件。

2 结果与分析

2.1 饲料原料及酶解豆粕中化学成分或抗营养物质组成 如表2 所示，豆粕与麦麸（比例7∶3）在经过酶解加工过后，CP、GE 和DM 含量提高，而氨基酸的相对含量变化不大。与此同时，豆粕麦麸混合型酶解豆粕的NDF 含量较豆粕原料提高了近10%。豆粕原料中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白含量均为70 mg/g 左右，排除麦麸的稀释效应后，豆粕中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的降解效率均为20%。酶解过程伴随着自然微生物的发酵作用[13]，促使了原料中寡糖的降解和挥发性脂肪酸的产生。本试验所用的豆粕中果糖含量最丰富。经过酶解后，酶解物料中的果糖含量由58.52 mg/g（豆粕和麦麸7∶3 混合）降解至28.05 mg/g（酶解豆粕）。与此同时，小麦麸中除了含有23.05 mg/g 果糖以外，还含有15.80 mg/g 蔗糖和0.98 mg/g 葡萄糖，小麦麸的葡萄糖含量远高于豆粕。豆粕和小麦麸原料中挥发性脂肪酸含量较低，酶解过后主要产生乙酸、乳酸、丁酸和异丁酸。

2.2 酶解豆粕蛋白分子量分布 豆粕麦麸混合型酶解豆粕中40～50 ku 的蛋白降解比较充分（图1）。

图1 原料中的蛋白分子量分布

2.3 酶解豆粕对断奶仔猪生长性能的影响 由表3 可知，与对照组相比，酶解豆粕麦麸混合物增加了断奶仔猪的28 d 体重（P＜0.05）。与对照组相比，饲粮添加酶解豆粕麦麸混合物提高了断奶仔猪1～14 d 的生长性能（P＜0.05）。与对照组相比，饲粮添加酶解豆粕麦麸混合物提高了断奶仔猪15～28 d 及1～28 d 的ADFI（P＜0.05），但FCR 与对照组差异不显著。

2.4 酶解豆粕对断奶仔猪腹泻率和粪便评分的影响 由表4 可知，与对照组相比，饲粮添加酶解豆粕降低了断奶仔猪1～14、15～28 d 及1～28 d 的腹泻率和粪便评分（P＜0.05）。

3 讨 论

3.1 酶解豆粕和饲料原料中营养物质和抗营养物质组成本试验中所用的豆粕原料中氨基酸、DM 以及GE 含量与文献报道结果相吻合。Stein 等[1]对猪用饲料原料营养成分进行了总结，豆粕经过发酵或酶解处理过后，蛋白含量会上升，本研究中酶解物料的蛋白质干物质含量提高了4.73%。Kim 等[14]研究了不同豆粕加工方式对断奶仔猪回肠氨基酸消化率的影响，发现经由枯草芽孢杆菌参与制取的发酵豆粕在提升CP 水平的同时，还具有更高的标准回肠可消化氨基酸（SIDAA）。本试验中，日粮配方综合考虑了酶解豆粕氨基酸消化率的变化情况，而酶解豆粕的SIDAA仍需要进一步研究。魏金涛等[15]利用木瓜蛋白酶和酵母菌在40℃条件下制取豆粕的液态酶解发酵物，其饲喂于生长育肥猪可以提高生产性能，降低粪中氮、磷、铜和锌的排放量。酶解过程中的自然微生物发酵对物料中寡糖的降解和挥发性脂肪酸产生具有重要作用[13]。据NRC[11]报道，豆粕中的寡糖主要为蔗糖、棉籽糖和水苏糖，而对其果糖含量关注较少。本试验所用的豆粕具有较高的果糖含量。前期试验结果表明，纯豆粕制取的酶解豆粕中 Fructobacillus 菌能够大量繁殖并成为优势菌，Fructobacillus 菌相比于魏斯菌更加偏好果糖而不是葡萄糖[13]。小麦麸中葡萄糖含量要明显高于豆粕，因此这也解释了为何魏斯菌成为豆粕麦麸混合型酶解豆粕中的优势菌。Fructobacillus菌相比于魏斯菌而言更偏向于发酵产乙酸，原因在于魏斯菌的乙醛/乙醇脱氢酶基因（adhE）表达量低，其在发酵过程中更偏向于产生乙醛或乙醇[16]。纯豆粕型酶解豆粕偏酸，而豆粕麦麸混合型酶解豆粕则有醇香味且酸度较低。而低酸度的条件下，允许了豆粕麦麸混合型酶解豆粕中酵母菌的生长，使其进一步发酵产醇，醇香味更加丰富。

表2 试验原料化学组成（绝干物质基础）

表3 角蛋白酶酶解豆粕对断奶仔猪生长性能的影响

表4 酶解豆粕对断奶仔猪腹泻率及粪便评分的影响

3.2 酶解豆粕对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响 在日粮中添加角蛋白酶体外酶解豆粕能够促进仔猪断奶后28 d 内的生长。制取酶解豆粕需要6 kg/t 的角蛋白酶，换算成日粮配比，相当于在饲料配方中使用0.075%的角蛋白酶。已有研究表明，添加0.05%～0.10%的角蛋白酶对仔猪具有促生长作用[6]。然而，与对照组相比，酶解豆粕组有着更高的采食量与更低的腹泻率和粪便评分，说明酶解豆粕对于仔猪健康有着不可忽视的促进作用。本研究结果表明，豆粕麦麸混合型酶解豆粕显著降低了断奶仔猪的腹泻率和粪便评分。另一方面，豆粕麦麸混合型酶解豆粕显著降低了豆粕中的抗营养因子β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的含量，从而提高酶解豆粕品质，降低断奶仔猪的腹泻率。

4 小 结

角蛋白酶体外酶解豆粕麦麸混合物可以降低豆粕中的抗营养因子β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白含量，在断奶仔猪日粮中替代豆粕能够提高断奶后1～14 d 仔猪的生长性能，显著降低整个试验过程中断奶仔猪的腹泻率和粪便评分。