枯草芽孢杆菌发酵制剂对饲喂含黄曲霉毒素B1饲料肉鸡免疫功能的影响

张桂枝，刘 璐，靳双星*，王卫民

（1.河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技术研究中心，河南郑州 450046；3.河南智龙生物科技有限公司，河南新乡 453731）

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等多种真菌产生的有毒代谢产物[1]。在十多种次级代谢产物中，黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种分布最广、毒性高和诱变致癌性强的真菌次级代谢产物，其毒性是氰化钾的10 倍，砒霜的68 倍[2]。若动物采食一段时间被黄曲霉毒素污染的饲料后，会引起采食量下降、生产性能降低，后期还会导致黄疸、肝脏肿大、免疫抑制和癌变等[3]。残留在动物体内的AFB1可通过食物链威胁人类健康。据联合国粮农组织（FAO）2002 年调查显示，目前世界上每年受到霉菌毒素不同程度污染的谷物量至少达25%，黄曲霉毒素的危害最为严重[4]。有研究证明，玉米、麸皮、饼粕类和酒糟蛋白饲料（DDGS）中AFB1的检出率分别高达50%、46%、36%和94%[5]。因此，控制和降解霉菌毒素的污染迫在眉睫。

据报道，枯草芽孢杆菌微生态制剂具有耐酸、耐盐、耐高温、易储存加工和运输等特性[6]，在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持高活性；能自身合成蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等，可有效降解复杂的碳水化合物和黄曲霉毒素[7-11]，还能刺激动物免疫器官的生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体含量，增强细胞免疫和体液免疫功能[12-15]；还能改善肠道微生态环境，促进动物生长和提高抗病力[16-18]。本试验旨在研究添加枯草芽孢杆菌发酵制剂对饲喂含AFB1饲粮的肉鸡免疫功能的影响，验证枯草芽孢杆菌发酵制剂在体内试验中的有效性，为减轻AFB1的危害及该制剂在生产中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 枯草芽孢杆菌体外对AFB1的降解作用 将枯草芽孢杆菌（由河南农业大学微生物实验室提供）接种到LB 液体培养基中，37℃摇床培养72 h，取其发酵液8 000 r/min离心15 min，然后取上清液0.8 mL 加入0.2 mL100 μg/kg AFB1标品（Sigma 公司）；空白对照为0.8 mL LB 液体培养基加入0.2 mL100 μg /kg AFB1标品，静置反应3 d。采用ROMER 国际贸易（北京）有限公司提供的AFB1检测试剂盒测定AFB1含量，并计算AFB1降解率。

AFB1降解率=（空白对照AFB1含量－试验组AFB1含量）/空白对照AFB1含量×100%

1.2 枯草芽孢杆菌发酵制剂生产工艺 将枯草芽孢杆菌接种到LB 液体培养基（北京华越洋生物公司）中，在37℃、200 r/min 条件下摇床培养16～18 h 后，调整活菌数达1×109CFU/mL；取发酵液按4%接种量与经灭菌的含有麸皮、葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁等固体培养基混匀接种，随后在37℃条件下发酵72 h，低温干燥制成，有效活菌数≥1×108CFU/g，由河南智龙生物科技有限公司生产。

1.3 试验设计及饲养管理 200 只1 日龄AA 肉仔鸡（购于开封大富种禽有限公司）观察饲养至5 日龄时，选取180 只称重并随机分为3 组，每组5 个重复，每个重复12 只，性别比例一致。A 组饲喂基础饲粮（开封正大公司）；B 组在基础饲粮中添加100 μg/kg AFB1；C 组在B 组基础上添加0.1%枯草芽孢杆菌发酵制剂。

试鸡采用网上平养方式，前3 d 每天24 h 光照，温度控制在32～35℃，湿度65%～70%，之后温度、湿度适当降低。鸡自由采食、饮水，3 组鸡均在7 日龄1.5倍量点眼滴鼻接种新城疫疫苗，14 日龄1.5 倍量滴口接种法氏囊疫苗（浙江诺倍威生物技术有限公司），21日龄3 倍量饮水免疫新城疫疫苗。按鸡场管理程序进行饲养管理，饲养周期为42 d。

1.4 新城疫（ND）血清抗体滴度的测定 采用HA-HI试验。分别于14、21、28、35 日龄，每组取10 只，每个重复随机取2 只翅静脉采血，自然状态析出血清，按《新城疫诊断技术》（GB/T 16550-2008）检测A、B、C 组鸡血清中的ND-HI 效价，进行统计分析。

1.5 法氏囊（IBD）血清抗体滴度的测定 于21、28、35 日龄，每组取10 只，每个重复随机取2 只，翅静脉采血，自然状态析出血清，采用间接ELISA 方法（ELISA酶标仪为Thermo 公司生产）检测血清中IBD 抗体（检测试剂盒购自美国IDEXX 公司），并计算各组抗体效价的平均值。

log10 抗体效价=1.1×log[（待检样品的平均OD值－阴性对照的平均OD 值）/（阳性对照的平均OD 值－阴性对照的平均OD 值）]+3.361

抗体效价=逆对数

1.6 血清免疫指标和免疫器官指数的测定 各组饲喂至42 日龄，每组取15 只，每个重复随机取3 只，采集血液，3 000 r/min 离心10 min 分离血清。同时摘取脾脏、法氏囊、双侧胸腺，剥离脂肪和结缔组织，称其重量并计算免疫器官指数。血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量的测定按照南京建成生物工程研究所生产的试剂盒说明进行。

免疫器官指数=免疫器官重量（g）/体重（kg）1.7 统计分析 数据应用SPSS 23.0 统计分析软件进行单因素方差分析，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。结果均以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌体外对AFB1降解效果 将枯草芽孢杆菌在37℃培养72 h，其发酵液对AFB1的降解率达到85.33%，证明该菌发酵液具有较强的降解AFB1的能力。

2.2 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AA 肉鸡ND-HI 效价的影响 由表1 可知， B 组14 日龄鸡血清中ND-HI 效价低于A 组和C 组（P＞0.05）；B 组21、28、35 日龄鸡ND-HI 效价与A 组相比分别显著降低了0.4log2、1.0log2和 1.2log2（P＜0.05），说明AFB1能显著降低AA 肉仔鸡ND 疫苗免疫效果。C 组21、28、35 日龄鸡ND-HI效价较B 组分别显著提高了0.6log2、1.1log2 和1.3log2（P＜0.05），A、C 组间无显著差异，说明枯草芽孢杆菌发酵制剂能显著改善AFB1对ND 疫苗免疫的影响，使ND 疫苗免疫效果恢复到正常水平。

表1 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AA 肉鸡ND-HI 效价的影响

2.3 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AA 肉鸡IBD 抗体效价的影响 由表2 可知，B 组21、28、35 日龄鸡血清中IBD 抗体值较A 组分别降低30.24%、39.95%和42.22%（P＜0.05），说明AFB1能显著降低AA 肉仔鸡IBD 疫苗免疫效果。C 组21、28、35 日龄鸡血清中IBD 抗体值较B 组分别提高了37.16%、63.82%和79.50%（P＜0.05）；3 个日龄A、C 组间鸡血清中IBD抗体均无显著差异，说明枯草芽孢杆菌发酵制剂能显著改善AFB1对IBD 疫苗免疫的影响，使IBD 疫苗免疫效果恢复到正常水平。

表2 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AA 肉鸡IBD 抗体效价的影响

2.4 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AA 肉鸡免疫器官指数的影响 由表3 可知，B 组鸡脾脏指数略高于A、C 组（P＞0.05）。B 组胸腺和法氏囊指数较A 组分别降低25.65%和 21.43%（P＜0.05），说明AFB1中毒能抑制AA 肉仔鸡胸腺和法氏囊的发育，导致胸腺、法氏囊指数降低。C 组胸腺和法氏囊指数较B 组分别提高了38.73%和 24.24%（P＜0.05），A、C 组间无显著差异，说明饲料中添加枯草芽孢杆菌发酵制剂能够改善AFB1对胸腺和法氏囊发育抑制作用的影响，使AA 肉仔鸡胸腺和法氏囊发育恢复到正常水平。

表3 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AA 肉鸡免疫器官指数的影响

2.5 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AA 肉鸡血清中免疫球蛋白的影响 由表4 可知，B 组鸡血清中IgA、IgG 和IgM 水平较A 组分别降低16.72%、56.61%和30.44%（P＜0.05），说明AFB1中毒能显著降低AA 肉仔鸡血清中IgA、IgG 和IgM 含量。C 组鸡血清中IgA、IgG和IgM 水平较B 组分别提高了57.16%、139.08%和114.86%（P＜0.05），A、C 组间无显著差异，说明饲料中添加枯草芽孢杆菌发酵制剂能显著提高饲喂AFB1肉仔鸡血清中IgA、IgG 和IgM 水平，减少AFB1对其抑制作用的影响，使其恢复到正常水平。

表4 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AA 肉鸡血清中免疫球蛋白的影响 μg/mL

3 讨 论

3.1 枯草芽孢杆菌体外对AFB1的降解作用 本试验选用的枯草芽孢杆菌，其发酵上清液对AFB1的降解率为85.33%；雷元培等[19]从动物肠道中分离得到的枯草芽孢杆菌，其发酵上清液对AFB1的降解率为 81%；张盼等[11]从纳豆中筛选到的枯草芽孢杆菌Natto3 具有较强的降解AFB1的能力，降解率受培养时间、温度、pH、金属离子等影响。Farzaneh 等[20]从伊朗开心果中分离得到枯草芽孢杆菌UTBSP1，对开心果样品中AFB1的降解率达到 95%。孙玲玉[7]从泰山脚下土壤中分离出具有降解 AFB1作用的枯草芽孢杆菌，其发酵上清液对AFB1的降解率达 90.28%。枯草芽孢杆菌对AFB1的降解可能是由于其代谢过程中所产生的酶作用，其作用机制还有待研究。

3.2 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AFB1中毒AA 肉仔鸡血清中ND 和IBD 抗体效价的影响 黄曲霉毒素能影响动物免疫系统，引起B 淋巴细胞活性降低、抗原递呈细胞和吞噬细胞功能受到影响，干扰免疫接种与体内获得性免疫，降低机体的免疫应答能力。吕武兴等[21]研究表明，日粮中AFB1含量为50 μg/kg 和75 μg/kg 时可影响肉鸭禽流感抗体合格率，降低禽流感疫苗的有效性。本试验中，饲粮中添加100 μg/kg AFB1能显著降低AA肉仔鸡ND 和IBD 疫苗的免疫效果；添加枯草芽孢杆菌发酵制剂能明显改善AFB1中毒导致ND 和IBD 抗体效价下降的状况，使ND 和IBD 疫苗免疫效果恢复到正常水平。

3.3 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AFB1中毒AA 肉仔鸡免疫器官指数的影响 黄曲霉毒素能够诱导免疫器官的肿胀、萎缩或坏死，进而抑制家禽的免疫功能[22]。侯然然等[23]研究表明，肉仔鸡日粮中添加0.1 mg/kg AFB1会导致脾脏肿胀、胸腺和法氏囊萎缩。于正强[24]研究表明，AFB1可通过活化线粒体和死亡受体途径引起胸腺细胞过度凋亡，通过活化线粒体和内质网介导的细胞凋亡调控途径引起雏鸡法氏囊细胞过度凋亡。本试验中，饲粮中添加100 μg /kg AFB1能显著降低AA 肉仔鸡胸腺和法氏囊的发育，添加草芽孢杆菌发酵制剂能够改善AFB1对胸腺、法氏囊发育的抑制作用，使其恢复到正常水平。枯草芽孢杆菌发酵制剂能够促进免疫器官的发育，究其原因，首先是免疫器官的生长发育和成熟有赖于抗原的刺激；芽孢杆菌作为非特异性免疫因子，通过细菌本身或细胞壁成分刺激机体免疫细胞，使其激活，产生促分裂因子，促进细胞活力或作为佐剂发挥作用；另外，芽孢杆菌在肠道内可合成维生素、氨基酸等多种有益物质，直接促进免疫器官的生长发育[25]。

3.4 枯草芽孢杆菌发酵制剂对AFB1中毒AA 肉鸡血清中免疫球蛋白的影响 黄曲霉毒素通过不同机制抑制动物和人体DNA、RNA 和蛋白合成[26]。Turner 等[27]研究发现，接触了黄曲霉毒素的儿童唾液中免疫球蛋白A（slgA）水平明显下降。本试验中，饲粮中添加100 μg/kg AFB1能显著降低AA 肉仔鸡血清中IgA、IgG 和IgM 含量。枯草芽孢杆菌具有免疫增强作用，能够提高免疫球蛋白和抗体含量。孙焕林[28]报道饲料中添加枯草芽孢杆菌发酵棉籽粕能显著提高肉鸡血清中IgA 和IgM 含量。李卫芬等[29]研究报道，肉鸡日粮中添加适量的枯草芽孢杆菌制剂可以显著提高IgA 的分泌。余东游等[25]报道，日粮中添加枯草芽孢杆菌可显著提高肉鸡血清中IgG 水平。本研究结果表明，枯草芽孢杆菌发酵制剂能明显改善AA 肉仔鸡因AFB1中毒引起的血清IgA、IgG 和IgM 含量降低现象，减少AFB1对机体的免疫抑制作用，使IgA、IgG 和IgM 水平恢复正常。

4 结 论

本试验条件下，基础饲粮中添加AFB1可导致AA肉仔鸡ND 和IBD 疫苗的有效性降低、胸腺和法氏囊的指数降低及血清中IgA、IgG、IgM 含量降低。添加枯草芽孢杆菌发酵制剂能明显改善AA 肉仔鸡AFB1中毒对ND 和IBD 疫苗免疫效果、免疫器官发育及免疫球蛋白含量的影响，使其恢复至正常水平。