HPLC法测定降糖益肾丸中毛蕊花糖苷的含量

谢 瑜，雷 昌，王 青*，梁晓岚，邹菊英

(1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005；2.湖南中医药大学/湖南省中药粉 体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410208)

降糖益肾丸为湖南中医药大学第二附属医院用于治疗糖尿病肾病的常用院内自制中药，该药控制糖尿病肾病早期症状疗效确切，在多年临床应用中无明显不良反应，安全可靠。降糖益肾丸由生地、山药、益母草、黄芩等多味中药组成，具有益气养阴、活血化瘀、泻火解毒的功效[1]。方中生地为君药，现代化学和药理学研究表明，生地药材的化学成分主要包括环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、紫罗兰酮类、糖类等，其中苯乙醇苷类代表性化合物毛蕊花糖苷，具有抗氧化、肾功能保护、免疫调节、抗细胞凋亡等作用[2-3]。

目前降糖益肾丸质量标准仅采用薄层色谱法对部分药味进行鉴别，专属性较低，缺少方中有效成分的含量控制。为了控制降糖益肾丸的质量，确保用药安全有效，亟需提高该药的质量标准。因此，本研究以毛蕊花糖苷为检测指标，采用HPLC法对其进行含量测定，以期进一步完善降糖益肾丸的质量标准。

1 仪器与材料

Agilent 1260 LC(安捷伦科技有限公司)；Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；电子分析天平T-214(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

降糖益肾丸由湖南中医药大学第二附属医院制剂室生产提供(批号：20170901、20170912、20170924)。毛蕊花糖苷对照品(批号：111530-201713)购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯，实验用水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品适量，置100 mL量瓶中，加无水甲醇溶解并定容至刻度，摇匀后制成每1 mL中含毛蕊花糖苷30.4 μg的对照品溶液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取其续滤液，即得。

2.1.2 供试品溶液制备 取本品细粉约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇100 mL，50 ℃温浸2 h，超声(功率：500 W，频率：40 kHz)提取30 min，滤过，减压回收提取液至干，残渣加无水甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液制备 除去生地的降糖益肾丸处方饮片，按处方比例和工艺要求制成缺生地的降糖益肾丸阴性样品，再按上述供试品溶液制备项下的方法制成阴性样品溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：25 ℃；检测波长为280 nm；流动相：A为乙腈，B为0.2%磷酸溶液，按表1中的规定进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱条件

按照拟定的色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定并记录色谱图。结果表明，供试品色谱图在与对照品色谱图相应保留时间处，有一相同的色谱峰，而阴性样品溶液未见该峰，表示无阴性干扰成分。供试品色谱峰的分离度、拖尾因子、理论板数均能达到系统适应性要求，结果见图1。

2.3 毛蕊花糖苷的线性关系考察

按照拟定的色谱条件，精密吸取上述“2.1”项下的毛蕊花糖苷对照品溶液2、4、6、8、10、12 μL进样，测定峰面积，以对照品进样量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标进行线性回归，求得其回归方程为：Y=0.879 7X+4.079 8，r=0.999 7，表明毛蕊花糖苷在60.8～364.8 ng质量范围内与峰面积呈良好的线性关系。

A.毛蕊花糖苷对照品；B.降糖益肾丸供试品；C.降糖益肾丸阴性样品

图1 降糖益肾丸中毛蕊花糖苷的HPLC色谱

2.4 精密度试验

精密吸取“2.1”项下的同一批号(20170912)降糖益肾丸供试品溶液，在上述HPLC条件下，连续进样6次，记录毛蕊花糖苷峰面积，计算求得其RSD值为0.92%。结果表明，该方法的精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取同一批号降糖益肾丸供试品溶液，在上述色谱条件下，常温时分别于制备后0、2、4、8、12、24h依次进样测定，记录毛蕊花糖苷的峰面积值，计算其RSD值为0.92%。结果表明，降糖益肾丸样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验

称取降糖益肾丸同一批样品(批号：20170912)约10 g，共6份，精密称定，按上述“2.1”项下方法制成供试品溶液，在所确定的色谱条件下分别测定毛蕊花糖苷的含量，计算其平均含量为0.039 0 mg/g，RSD为0.95%，结果表明，该测定方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的降糖益肾丸细粉(批号：20170912，毛蕊花糖苷含量为0.039 0 mg/g)约10 g，精密称定6份，分别精密加入30.4 μg/mL毛蕊花糖苷对照品溶液10 mL(相当于0.304 mg)，按上述“2.1”项下方法制成供试品溶液进样测定，计算毛蕊花糖苷含量、回收率和RSD值，结果平均回收率为97.56%，RSD为1.04%。见表2。

2.8 样品含量测定

取3批降糖益肾丸样品(批号：20170901，20170912，20170924)按照上述“2.1”项下的方法制备成样品溶液。在所确定的色谱条件下，测定毛蕊花糖苷含量，测得3批降糖益肾丸样品中毛蕊花糖苷含量分别为0.039 0 mg/g、0.038 9 mg/g、0.039 9 mg/g。

3 讨论

本实验采用不同比例提取溶剂(50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇) 超声提取，结果表明100%甲醇提取的供试品溶液进入液相后其他成分的干扰大，结果见图2。

表2 回收率试验结果

图2 降糖益肾丸的HPLC色谱

采用50%甲醇溶液、75%甲醇溶液则可避开多杂质出峰，为提高提取效率，选择75%甲醇溶液超声提取；考虑到降糖益肾丸为全生药粉制丸的口服固体制剂，故超声提取前于50 ℃温浸2 h有利于有效成分充分溶出。

目前国内外现代医学对糖尿病肾病治疗主要采取控制血糖、血压及抗肾病对症处理，尚无满意的防治方法，药物仅能改善患者相关症状，存在易复发、副作用大等缺点[4]。中医理论指导下应用复方中药治疗糖尿病肾病具有作用温和、疗效持久、毒副作用小的优势[5]，但其复杂的成分体系使得其药效物质基础研究困难。因此，本研究通过高效液相法测定降糖益肾丸中毛蕊花糖苷的含量，不仅为本制剂的质量标准提供依据，同时对于降糖益肾丸抗糖尿病肾病的物质基础研究具有重要意义。