寨卡病毒与男性(雄性)生殖健康

寨卡病毒是黄病毒科黄病毒属的单股正链、有包膜RNA病毒，病毒颗粒呈对称的20面体结构，直径约为50 nm[1-2]。病毒基因组长约10.8 kb，具有一个开放阅读框，编码3个结构蛋白(C, PrM及E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5)[1-2]。该病毒可分为西非世系、东非世系及亚洲世系[3]，主要经由埃及伊蚊、白纹伊蚊叮咬传播[4]。人类感染后可引起寨卡病毒病。

自1947年首次分离至2007年，全球范围仅报道了14例ZIKV感染病例，感染者均无严重临床症状，仅见头痛、发烧、皮疹、肌肉关节痛等[5-7]，因此未引起关注。但2013以来，寨卡疫情频发并伴有重症病例：首先，ZIKV在法属波利尼西亚及巴西等地区暴发流行，部分成年感染者出现吉兰巴雷综合症[8-9]；2015年，巴西ZIKV流行期间报道了东北地区胎儿小头畸形病例数增加了20倍[10]，使该病毒受到广泛关注。为此，2016年2月，世界卫生组织(World Health Organization, WHO)将ZIKV列为国际关注的突发公共卫生事件[11]。我国迄今只有输入病例，尚未发生本地流行[12]，但与我国西南地区相邻的东南亚多国均已出现ZIKV疫情[13], 加之我国具有丰富的蚊媒种群，与疫区有接壤漫长的边境线及频繁的商贸往来，使得我国ZIKV防控面临巨大的挑战。

1 ZIKV可感染男性生殖系统

与其它已知的黄病毒不同，除蚊虫叮咬外，ZIKV还可以经其他方式传播，如垂直传播[10]和性传播，特别是后者，在蚊媒病毒中十分罕见。ZIKV的性传播最早发现于2008年，当时一名在塞内加尔感染ZIKV的科研人员返回美国后将病毒传染给妻子[14]，而后者无近期疫区旅行的记录，提示ZIKV可能通过性途径传播。2016年，非流行区域的13个国家报道了27起类似病例。随着更多病例被报道，ZIKV还被明确可以在男男[15]、男女之间通过性途径互相传播[16-19]，且以男性传染女性为多见，约占全部性传播病例的92.5%[20]。

临床资料显示，ZIKV男性感染者可出现前列腺炎、血精等症状[14,17,21]，且精液中可见白细胞存在[22]，提示ZIKV可能损伤了男性泌尿生殖系统；部分感染者在病毒血症消失后，其精液中仍可检出病毒[16]，甚至在感染后69 d仍可检出具有感染能力的病毒颗粒[23-24]，而ZIKV RNA也可在精液中存在长达6个月之久[25]。除显性感染者精液中可检出ZIKV，隐性感染者也可以检出，美国研究人员在波多黎各和佛罗里达州ZIKV暴发期间，在14例无症状ZIKV感染者中发现5例ZIKV RNA阳性的精液样本，阳性率为35.7%，病毒载量为8.03×103～2.55×106拷贝数/mL[26]；此外，尚有文献报道输精管结扎的男性在感染ZIKV后96 d精液中仍可检出病毒RNA，提示ZIKV可能在除睾丸(testis)外的泌尿生殖系统器官中复制增殖，如前列腺(prostate)[27-29]。

目前有多个研究小组利用免疫缺陷小鼠建立ZIKV性传播模型，发现雄性小鼠在感染ZIKV后，约60%～70%个体的精液中可检出ZIKV[30-31]，通过性行为传染给雌性小鼠的概率约为50%[32]，而免疫健全的野生型小鼠感染ZIKV未见明显症状及病毒复制。Ma等发现敲除I型干扰素受体的小鼠经腹腔注射(intraperitoneal injection, i.p.)感染ZIKV可导致小鼠睾丸、附睾产生炎症继而发生永久性损伤[33]；也有研究团队应用IRF3/7 双敲除小鼠对ZIKV感染雄性泌尿生殖系统的能力进行研究[34]，免疫组化(immunohistochemical analysis, IHC)实验显示，在输精管的精液中含有大量表达ZIKV抗原的细胞，主要为脱落的上皮细胞。

虽然免疫缺陷小鼠在研究ZIKV感染上应用广泛，但人类与小鼠的精子发生过程有很大不同[35]，且有多篇文献报道固有免疫在黄病毒感染机体的过程中发挥了重要作用[36]，故应用免疫缺陷小鼠作为模型取得的研究结果来解释ZIKV感染对人类男性泌尿生殖系统的影响有一定的局限性。有研究尝试利用人类活检睾丸组织进行ZIKV感染实验[37]，但人类睾丸组织获取难度大难以满足研究需要，因此，利用灵长类动物建立ZIKV感染模型开展相关研究更能模拟人类疾病的病理过程。目前，有文献报道猕猴、食蟹猴等灵长类动物对不同株系的ZIKV易感[38-39]，其中猕猴感染ZIKV后症状与人类相似并能产生病毒血症[38,40-41]：病毒血症在感染后2～6 d到达高峰，感染后10～14 d消失，病毒血症消失后睾丸中仍可检出大量ZIKV[39,42]，且ZIKV在猕猴中可以通过垂直途径[43]及性途径传播[41]。

上述研究均表明，ZIKV可广泛感染男性泌尿生殖系统并长期存在于男性感染者的精液中，且不同株型的ZIKV均能感染男性生殖系统的多个器官并可通过性途径传播。因此，研究ZIKV对男性生殖系统的损害，特别是阐明靶细胞，对于深入阐明其致病机制和研发相关防治手段具有重要意义。

2 男性泌尿生殖系统的结构特点及ZIKV感染机制的研究

已知男性生殖系统由睾丸、附睾(epididymis)、前列腺和精囊组成，其中，睾丸、附睾是精子生成和成熟的重要器官。为深入阐述ZIKV性传播的具体机制，研究人员利用不同的动物模型，探究了ZIKV在雄性泌尿生殖系统内的靶细胞。

睾丸是产生精子与合成雄激素的重要器官，对男性进行有性生殖及维持第二性征起着至关重要的作用。哺乳动物的睾丸主要由曲细精管及管间填充的间质组织构成，外侧被白膜包裹。曲细精管由睾丸支持细胞(sertoli cells, SCs)、生殖细胞(germ cells, GCs)构成的上皮及管周肌样细胞(myoid cells, MCs)、基膜构成的管壁所组成，睾丸中的SCs在精子的发生过程中提供营养，同时SCs也表达能够作为多种病毒受体的TAM(Tyro3、Axl及Mer)分子[44]，更重要的是，SCs参与血睾屏障(blood-testis barrier, BTB)的形成，在维持睾丸免疫豁免环境中起到关键作用[45-48]。GCs存在于曲精小管内，发育成精子后会通过曲精小管进入附睾进一步发育成熟。间质组织主要包括睾丸间质细胞(leydig cells, LCs)和免疫细胞，LCs主要存在于曲精小管间的结缔组织中，其最重要的作用是合成和分泌雄激素，促进精子的发生并维持男性第二性征[49-50]；免疫细胞主要包括睾丸巨噬细胞(testicular macrophages, TMs)、T细胞及极少量的B细胞[51]，其中绝大多数为TMs，有研究表明在大鼠睾丸间质组织的细胞中TMs占25%左右[52]，目前认为TMs可能与LCs在功能上存在一定的关联，但缺乏直接证据。

附睾是位于睾丸下游的细小管状器官，紧贴睾丸，可分为头、体、尾三部分，附睾上皮细胞可分泌附睾液参与精子成熟[53-54]，精子运输至附睾发育成熟后会储存在附睾尾中[55]。

前列腺是男性泌尿系统的重要组成部分，也是最大的男性生殖附属腺体，主要由腺体组织和肌肉构成，由包膜紧密包裹，具有多种生物学功能[56]，前列腺分泌物是精液重要的液体成分。

2.1ZIKV在睾丸细胞中的增殖和靶细胞探究 利用不同的动物模型和多种检测手段，目前发现男性生殖系统多器官内的多种细胞均对ZIKV易感。其中以睾丸内靶细胞种类较多，分述如下。

2.1.1Sertoli细胞 诸多研究报道了小鼠SCs是ZIKV感染睾丸的重要靶细胞[57-60]。Sheng等[61]观察到ZIKV感染可以引起雄性AG6(I型和II型干扰素受体缺陷)小鼠生殖系统病变，感染后的小鼠血清雄激素水平改变，精液和睾丸的病毒载量高于其他脏器。病理学检查可见睾丸出现曲精小管萎缩、管腔狭窄等变化，同时构成血睾屏障的重要组分紧密连接蛋白表达下调、分布紊乱。该研究还通过免疫荧光染色证明在SCs中，ZIKV抗原染色阳性，且在电镜下可以观察到SCs内存在病毒颗粒。结果提示，SCs是ZIKV的易感细胞。

美国Diamond团队[60]应用注射阻断Ifnar1单克隆抗体的野生型小鼠感染ZIKV非洲株 (Dakar 41519)，利用原位杂交技术(in situ hybridization，ISH)检测ZIKV RNA发现感染后7 d，小鼠睾丸SCs染色明显阳性；感染后14 d，IHC显示曲精小管受损、中心导管丧失，同时SCs有所减少；感染后21 d，睾丸失去正常结构，SCs大量丧失，该结果提示SCs是ZIKV感染的重要靶细胞。此外该研究还使用Axl-/-小鼠研究了Axl在ZIKV感染中的作用，ISH显示在感染病毒的Axl-/-小鼠SCs中有明显的阳性染色，故认为Axl可能不是介导ZIKV感染靶细胞的主要受体。

Osuna[39]等发现ZIKV同样可感染猕猴睾丸的SCs，猕猴的前列腺及精囊组织在病毒感染后35 d仍有ZIKV检出，同时，肾脏、膀胱及尿液中亦有ZIKV RNA检出。以上结果提示ZIKV在泌尿生殖系统中的存在位置可能较为广泛，不局限于生殖系统的睾丸、附睾、前列腺等器官，还涉及泌尿系统的器官，如肾脏或膀胱等。此外，该研究还发现与小鼠比较，ZIKV对猕猴睾丸结构损伤小、对生殖健康的影响有限，但病毒可持续大量存在，提示ZIKV对男性感染者生殖系统的影响需要长期密切观察。此外，尚有文献报道人类的原代SCs感染ZIKV后可支持病毒复制至少6周[62-63]，进一步支持SCs可能是ZIKV复制的重要靶细胞。

2.1.2生殖细胞 精子和睾丸生精细胞是否对ZIKV易感是研究者关注的另一焦点。研究获得最为直接的证据是利用透射电镜可在感染ZIKV小鼠的睾丸中直接观察到附着在精子上的ZIKV病毒颗粒[64]，以上结果证明ZIKV可以直接感染精子，提示精子可能是ZIKV性传播过程中的重要载体。进一步研究显示，ZIKV可能感染生精细胞、初级精母细胞[32,65]。Christopher L.等将ZIKV通过静脉注射(intravenous injection,i.v.)感染野生型小鼠后，小鼠精子数量明显减少。应用小鼠生殖细胞系进行体外实验发现ZIKV可感染97.2%的细胞，提示小鼠GCs对ZIKV易感[37]。为进一步确定ZIKV感染生殖细胞的机制，该课题组分别研究了野生型小鼠及Ifnar1-/-小鼠的SCs、LCs、GCs、MCs对ZIKV的易感性，结果发现，与Ifnar1-/-小鼠相比，野生型小鼠SCs、MCs感染率均明显降低，而两种小鼠GCs的感染率没有明显差别；RT-qPCR检测发现两种小鼠GCs中多种干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)均呈低表达，体外实验也发现经干扰素α(IFN-α)预处理可明显降低小鼠GCs的ZIKV感染率。以上结果均提示小鼠GCs对ZIKV易感。

该研究还发现感染ZIKV的GCs仍可继续生存，为ZIKV在精液中长期存在提供了依据。为探明这一现象的机制，该课题组应用登革病毒(Dengue virus, DENV)、黄热病毒(Yellow fever virus, YFV)及ZIKV分别感染小鼠GCs，3种病毒均可感染GCs，但只有ZIKV可以在GCs中高效复制且持续存在，RNA-seq表明Ifi44l(IFN-induced protein 44-like)基因在感染DENV或YFV的GCs中高表达而在感染ZIKV的GCs中其表达量无明显变化。已知Ifi44l基因属I型干扰素刺激基因(Type I interferon-stimulated gene, ISG)，属于IFI44家族[66]，有文献报道Ifi44l基因高表达可抑制丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)复制[67]。以上结果提示ZIKV感染可能抑制了GCs 中Ifi44l基因的表达，进而为ZIKV在其中复制、长期存在于精液中创造了条件。

2.1.3Leydig细胞 研究认为ZIKV感染后LCs的减少与睾丸的多种病理改变相关，即LCs减少导致雄性小鼠睾酮水平下降，引起小鼠精子成熟障碍、睾丸萎缩，继而导致感染的雄性小鼠性功能低下[33]。

在ZIKV感染早期，LCs即可检出少量病毒RNA[60]。研究发现ZIKV感染后5 d的Ifnar1-/-小鼠LCs内可检出ZIKV NS1蛋白抗原，睾丸中数种与睾酮产生相关的基因表达水平均出现下降；感染后21 d小鼠睾丸出现萎缩，且血清中睾酮水平低于对照组小鼠，说明ZIKV所致小鼠睾丸萎缩可能与LCs减少有关；体外实验也发现野生型小鼠的LCs可以高效地支持ZIKV复制，以上结果说明LCs也可能是ZIKV的靶细胞[31]。

2.1.4巨噬细胞 在2016年，Quicke等[68]发现ZIKV可感染人胎盘巨噬细胞(Hofbauer cells, HCs)并协助病毒穿入胎盘屏障，提示巨噬细胞在ZIKV致病过程中具有重要作用。由于睾丸间质中巨噬细胞数量较多，因此研究睾丸中巨噬细胞对ZIKV的易感性有重要意义。Siemann等[62]通过体外实验发现ZIKV可感染人巨噬细胞并刺激细胞分泌多种促炎症因子，作者认为这一过程与睾丸紧密连接蛋白的破坏有关；2017年Sheng等[61]进一步通过在体实验提供了ZIKV感染TMs的直接证据：感染ZIKV 后5d的雄性AG6小鼠睾丸中ZIKV抗原与巨噬细胞标志物 F4/80存在共染，说明TMs也是ZIKV感染的重要靶细胞。

表1 关于ZIKV感染与男性生殖健康研究的相关文献
Tab.1 Relevant literature on the relationship between ZIKV and male reproductive health

模型类别涉及器官靶细胞文献免疫缺陷小鼠睾丸LCs, GCs;SCs;SCs;SCs, TMs;SCs;SCs, LCs, GCs;GCs;GCs;GCs;Wenqiang Ma[33], et al, 2016;Chan JF[57], et al, 2016;Govero J[58], et al, 2016;Sheng ZY[61], et al, 2017;Siddharthan V[59],et al, 2017;Griffin BD[60] et al, 2017;Uraki R[31], et al, 2017;Winkler CW[65], et al, 2017;Duggal NK[32], et al, 2017;附睾Wenqiang Ma[33], et al, 2016; Uraki R[64], et al, 2017; Griffin BD[60], et al, 2017;前列腺上皮细胞;Clancy CS[69], et al, 2018;Chan JF[57], et al, 2016;非人灵长类或人体细胞睾丸SCs;SCs, TMs; SCs;Osuna CE[39], et al, 2016; Siemann DN[62], et al, 2017;Kumar A[63], et al, 2018前列腺上皮细胞,间质细胞Spencer JL[70], et al, 2018.

注：SCs是睾丸支持细胞；GCs是生殖细胞；LCs是间质细胞；TMs是睾丸巨噬细胞。

2.2ZIKV在附睾细胞中的增殖和靶细胞探究 附睾是精子成熟及存储的重要器官，与睾丸在解剖学上存在联系，故亦被认为是ZIKV感染的可能靶器官。ZIKV感染可导致雄性A6(I型干扰素受体缺陷)小鼠附睾产生炎症继而发生多种永久性损伤：附睾间质水肿浸润、附睾尾部及管腔内的生精细胞大量退化[33]，提示ZIKV感染可损伤附睾，但目前缺乏对ZIKV损伤附睾细胞及其机制的深入研究。

2.3ZIKV在前列腺细胞中的增殖和靶细胞探究 ZIKV男性感染者出现前列腺炎已被广泛报道，且输精管结扎术后的感染者精液中有ZIKV的检出，提示睾丸和附睾以外的生殖器官可能支持ZIKV的复制。研究人员利用多种动物模型首先研究了前列腺对ZIKV的易感性。Clancy等应用雄性AG129(I型和II型干扰素受体缺陷)小鼠构建 ZIKV感染模型[69]，发现小鼠阴囊及前列腺在感染后7、9、10、11 d均可检出ZIKV病毒抗原且于相同部位可检出病毒RNA，提示阴囊及前列腺的部分上皮细胞可支持ZIKV复制。Chan JF等人[57]通过i.p.途径使经地塞米松抑制免疫功能的BALB/c小鼠感染ZIKV后第5、12 d，小鼠前列腺内亦可检出ZIKV RNA。

为更好地研究ZIKV对前列腺的感染性，Jennifer等[70]利用人前列腺细胞系构建前列腺类器官后感染ZIKV，结果发现ZIKV可感染人前列腺间质细胞19I及人前列腺上皮细胞LNCaP，并在这些细胞中复制产生新的病毒颗粒；相比前列腺上皮细胞，前列腺间质细胞对ZIKV更加易感。进一步通过q-PCR等方法发现上述细胞表达Tyro3、TIM-1等黏附分子，该结果提示了ZIKV感染前列腺细胞的潜在机制。上述研究均说明ZIKV可在前列腺中复制增殖，同样也可能是病毒在精液中存在的潜在因素。

3 展 望

目前，ZIKV在全球范围内广泛流行，但尚无特效抗病毒药物及安全有效的疫苗用于防治。随着对ZIKV致病机制研究的深入，ZIKV对男性生殖系统的影响日渐引发人们的广泛关注。虽然动物水平实验可以部分解释ZIKV 损伤男性泌尿生殖系统的机制，但目前仍未明确介导ZIKV感染靶细胞的受体，以及ZIKV对男性生殖健康的远期影响。此外，在临床上，无症状ZIKV感染者可能在人群中有通过性途径传播ZIKV的潜在风险，因此，加强对ZIKV男性感染者的长期跟踪研究、深入挖掘临床数据并开发更加合理的ZIKV实验动物模型，对研究ZIKV在男性生殖健康的影响方面有着重要意义。