多重耐药肺炎克雷伯菌62种耐药基因元件的检测与gyrA基因突变的发现

据国家卫生健康委员会合理用药专家委员会2016年全国细菌耐药监测网报告，肺炎克雷伯菌仅次于大肠埃希菌占革兰阴性杆菌临床分离率第2位(达19.7%)。肺炎克雷伯菌对第3代头孢菌素的耐药率全国平均为 34.5%，对第3代头孢菌素耐药率最高的省份达为 58.1%。肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药率全国平均为8.7%(较2015年上升了1.1%),肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药率最高的地区达23.6%[1]。可见肺炎克雷伯菌临床分离率居高位,况且耐药性突出。我们收集25株耐药肺炎克雷伯菌进行了62种耐药元件基因检测,结果发现了2株不仅存在gyrA基因突变、同时又携带了blaKPC、rmtB基因的对喹诺酮类药物、碳青霉烯类药物、第3代头孢菌素、氨基糖苷类药物均为耐药肺炎克雷伯菌,现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源及菌种鉴定 25株耐药肺炎克雷伯菌均分离自2016-2017年江汉油田总医院住院病人标本。菌种鉴定为gyrA基因测序上网BLASTn比对法(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn),实验中非肺炎克雷伯菌已剔除。

1.2药敏试验 10种抗菌药物药敏试验为K-B纸片扩散法。10种抗菌药物依次为：头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美洛培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星。药敏纸片为英国Oxoid公司产品。药敏试验判断依据为2016年发布的CLSI M100-S26文件。

1.3细菌DNA制备 为非离子去污剂裂解和蛋白酶K溶液法，试剂盒为无锡市克隆遗传技术研究所产品。

1.4获得性耐药元件基因检测 25株耐药肺炎克雷伯菌62种耐药元件基因检测均为PCR法。检测项目见表1，引物序列由无锡新吴区新克隆数据分析工作室提供。试剂盒为无锡市克隆遗传技术研究所产品。各种耐药元件基因检测体系为: 正向P1引物P1 1 μL(1.0 μmol/L)、反向P2引物P2 1 μL(1.0 μmol/L),预混的dNTPs 2 μL (dATP、dTTP、dCTP、dGTP均为2 mmol/L),缓冲液2 μL [MgCl22mmol/L，Tris-HCl(pH9.0)10 mmol/L]，重组的rTaq DNA聚合酶1单位,纯水9 μL, DNA制备液5 μL,反应容量20 μL。PCR扩增参数为： 93 ℃预变性2 min下同，然后93 ℃ 1 min→55 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min，循环30次，最后一个72 ℃延长至5 min，产物作2%琼脂糖凝胶电泳，紫外线仪下观察结果。

1.5基因测序与分析 DNA测序委托上海铂尚生物技术公司完成。测得序列比对与分析在无锡新吴区新克隆数据分析工作室协助下完成。

1.6菌株亲缘关系分析 对62种耐药元件基因检测结果作UPGMA法样本聚类分析,由无锡新吴区新克隆数据分析工作室完成。

2 结 果

2.1药敏检测结果 25株耐药肺炎克雷伯菌10种抗菌药物药敏试验检测结果见表2。

2.2耐药元件基因检测结果 25株耐药肺炎克雷伯菌每株均检出β-内酰胺类药物耐药相关基因(即β-内酰胺类药物耐药相关基因总阳性率达100.00%)；有24株菌检出氨基糖苷类药物耐药相关基因(即氨基糖苷类药物耐药相关基因总阳性率达96.00%)；有20株菌检出喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA突变(即突变率为80.00%)；每株均检出可移动遗传元件遗传标记基因(即可移动遗传元件遗传标记基因总阳性率达100.00%),各类耐药元件基因阳性率见表3。本研究25株耐药肺炎克雷伯菌中20株存在喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA第83位密码子发生了同样的突变,且均无第87位密码子的突变(见图1),blaKPC、rmtB基因DNA测序见图2、3。

表1 25株耐药肺炎克雷伯菌耐药元件基因检测项目
Tab.1 Resistant determinants in 25 strains of drug-resistantKlebsiellapneumoniae

基因分类基因名称β-内酰胺类药物耐药相关基因(β-内酰胺酶基因,35种)1.A类β-内酰胺酶基因:blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1群、blaCTX-M-2群、blaCTX-M-8群、blaCTX-M-9群、blaCTX-M-25群、blaPER、blaVEB、blaGES、blaCARB、blaRTG、blaLAP、blaKPC;2.B类β-内酰胺酶基因:blaIMP、blaVIM、blaDIM、blaSIM、blaSPM、blaGIM、blaAIM、blaNDM、blaKHM、blaTMB ;3.C类β-内酰胺酶基因:blaLEN、blaOKP、blaDHA群、blaACT/MIR群、blaLAT/CMY群、blaMOX/CMY群、blaFOX群、blaACC群;4.D类β-内酰胺酶基因:blaOXA-1群、blaOXA-2群、blaOXA-10群氨基糖苷类药物耐药相关基因(15种)1.氨基糖苷类修饰酶基因:aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰb、aac(6’)-Ⅱ、ant(2”)-Ⅰ、ant(3”)-Ⅰ、ant(4’)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、aadA5;2.靶位16S rRNA甲基化酶基因:armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA喹诺酮类药物耐药相关基因(1种)gyrA基因突变可移动遗传元件遗传标记基因(11种)1.整合子遗传标记基因:intⅠ1、intⅠ2、intⅠ3;2.转座子遗传标记基因:tnpU、tnp513;3.插入序列遗传标记基因:ISEcp1、IS26、IS903、ISKpn6、ISKpn7;质粒遗传标记基因:trbC

表2 25株耐药肺炎克雷伯菌10种抗菌药物药敏试验检测结果
Tab.2 Result of drug sensitivity test of 25 drug-resistantKlebsiellapneumoniato 10 antimicrobial agents

药物名称敏感中介耐药株数敏感率/%株数中介率/%株数耐药率/%头孢呋辛00.00520.002080.00头孢噻肟00.00520.002080.00头孢他啶00.00520.002080.00哌拉西林/他唑巴坦1560.0000.001040.00亚胺培南2392.0000.0028.00美洛培南2392.0000.0028.00庆大霉素14.0000.002496.00阿米卡星14.0000.002496.00环丙沙星520.0000.002080.00左氧氟沙星520.0000.002080.00

2.3菌株亲缘关系分析 25株耐药肺炎克雷伯菌62种耐药元件基因的检测结果作样本聚类分析显示,可分A与B 2个簇群，2个簇群中均有克隆传播(见图4)。

3 讨 论

肺炎克雷伯菌不仅在临床标本中分离率高,近几年对抗菌药物耐药率不断上升，甚至出现了耐多粘菌素的菌株[1-6]。因此耐药肺炎克雷伯菌是国内感染学领域研究与追踪热点[7-14]。

本文25株耐药肺炎克雷伯菌对第3代头孢菌素(头孢噻肟、头孢他啶)、氨基糖苷类药物(庆大霉素、阿米卡星)、喹诺酮类药物(环丙沙星、左氧氟沙星)的敏感性均较低(敏感性均不足20.0%,见表2)，

表3 25株耐药肺炎克雷伯菌耐药元件基因检测阳性率
Tab.3 Positive rates of resistance determinants in 25 drug-resistantKlebsiellapneumonia

分类基因名称阳性株数%β-内酰胺类药物耐药相关基因blaTEM25100.00blaLAP1 4.00blaKPC2 8.00blaDHA群936.00blaOXA-1群312.00氨基糖苷类药物耐药相关基因aac(3)-Ⅱ1872.00aac(6’)-Ⅰb624.00ant(3”)-Ⅰ1560.00aph(3’)-Ⅰ936.00aadA52 8.00rmtB832.00喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA突变2080.00可移动遗传元件遗传标记基因intⅠ125100.00tnpU1144.00tnp5131664.00ISEcp11872.00IS262288.00IS9032288.00ISKpn62 8.00trbC1768.00

注： 未列出检测结果者均为检测呈阴性。

对复合制剂氨(哌拉西林/他唑巴坦)敏感率为60%尚可。对碳青霉烯类药物(亚胺培南、美洛培南)均为敏感,敏感率均达92.00%。

注：gyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区常见为密码子第83,87位2个位点发生突变,本文20株gyrA突变菌株均为第83位发生突变,第87位无突变发生。图1 喹诺酮类药物耐药相关基因gyrA突变分析Fig.1 gyrA mutation analysis of resistant genes to quinolones

本文菌株作了β-内酰胺类药物耐药相关基因共35种β-内酰胺酶基因检测,结果A类β-内酰胺酶基因检出blaTEM、blaLAP、blaKPC；B类β-内酰胺酶基因没有检出；C类β-内酰胺酶基因检出blaDHA群；D类β-内酰胺酶基因检出blaOXA-1群(各项检出率详见表2)。25株均检出β-内酰胺酶基因。A类β-内酰胺酶基因中blaKPC表达具碳青霉烯类药物水解活性的β-内酰胺酶,因此产KPC酶的菌对碳青霉烯类药物耐药。本研究菌株有2株呈阳性(8.00%),与碳青霉烯类药物耐药率相符(8.00%)。C类β-内酰胺酶基因表达AmpC型β-内酰胺酶，β-内酰胺酶抑制剂对该类酶无抑制作用。

图2 blaKPC测序(部分) Fig.2 Part sequence of bla KPC

图3 rmtB测序(部分) Fig.3 Part sequence of rmtB

图4 25株耐药肺炎克雷伯菌62种耐药元件基因检测结果的样本聚类分析(图中数字为菌株号) Fig.4 Sample cluster analysis of 62 resistance determinants in 25 drug-resistant Klebsiella pneumonia

本组菌株9株检出C类β-内酰胺酶基因blaDHA群(36.00%),与哌拉西林/他唑巴坦复合制剂耐药率40.00%大体一致。

本研究25菌株中有24株菌检出氨基糖苷类药物耐药相关基因(即氨基糖苷类药物耐药相关基因总阳性率达96.00%),与氨基糖苷类药物耐药率一致。氨基糖苷类药物耐药相关基因有氨基糖苷类修饰酶和靶位16S rRNA甲基化酶基因二类。氨基糖苷类修饰酶的耐药机制为, 修饰酶对氨基糖苷类药物的化学基团进行修饰,导致氨基糖苷类药物完全失效或部分失效。氨基糖苷类药物新药研发思路即为改变已知氨基糖苷类修饰酶修饰部位的化学基团,使得原先氨基糖苷类修饰酶无法修饰新的氨基糖苷类药物。16S rRNA甲基化酶的耐药机制为, 甲基化酶对氨基糖苷类药物作用的靶位甲基化,导致氨基糖苷类药物无法作用而失效。亦即16S rRNA甲基化酶引起的耐药较氨基糖苷类修饰酶引起的耐药更为严重。16S rRNA甲基化酶的出现直接导致原先的氨基糖苷类药物新药研发思路无用了。本研究25菌株中有8株菌(32.00%)检出16S rRNA甲基化酶基因rmtB,即该8株对未来的氨基糖苷类药物新药亦将耐药。

喹诺酮类药物耐药主要原因为细菌的药物作用靶位DNA回旋酶编码基因gyrA突变,变异后的DNA回旋酶不与喹诺酮类药物结合,药物无效。gyrA基因突变常见发生于密码子第83、87位2个位点。本文25菌株中有20株gyrA发生突变(均为第83位发生突变,第87位无突变)。

近年国内有较多耐药肺炎克雷伯菌耐药基因研究报道,但主要涉及β-内酰胺类药物耐药相关基因和氨基糖苷类药物耐药相关基因的报道较多[7-14]。涉及喹诺酮类药物耐药相关基因的报道较少[13-14]。

本文菌株可移动遗传元件遗传标记基因检出率较高, 整合子遗传标记基因、转座子遗传标记基因、插入序列遗传标记基因、质粒遗传标记基因均有检出,检出率详见表3。可移动遗传元件是β-内酰胺类药物耐药相关基因和氨基糖苷类药物耐药相关基因的载体,本文菌株该三者检出率高能互为佐证。

本文对25株耐药肺炎克雷伯菌62种耐药元件基因检测结果作了样本聚类分析,从图4可见菌株分A与B二簇群, 2个簇群中均有克隆传播。A簇群中有2个克隆,分别为2号株-3号株-5号株-16号株等4株、13号株-14号株等2株；B簇群中有1个克隆,为19号株-20号株等2株。其中A簇群中13号株和14号株均存在gyrA突变,同时携带了blaKPC、rmtB、ant(3”)-Ⅰ、intⅠ1、tnp513、ISEcp1、IS26、IS903、ISKpn6基因。13号株和14号株的gyrA突变决定它们对喹诺酮类药物耐药,携带blaKPC导致对碳青霉烯类药物、第3代头孢菌素耐药,携带rmtB导致对氨基糖苷类药物耐药。这3个基因导致菌株对一线抗菌药物均为耐药。