江西省赣州市蜱携带立克次体和埃立克体的调研

韩 茜1，许红彬2，冯 云1，田俊华3，章少在2，吴 敏4，张 婧1，潘 虹1，李元元，梁国栋

立克次体病是一类严重威胁人类健康的人兽共患自然疫源性疾病，其病原体立克次体目(Rickettsiales)微生物是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，其形态结构、化学组成和代谢方式等方面与细菌类似，通过蜱、螨、蚤等节肢动物叮咬人和动物而传播[1]。《伯杰氏系统细菌学手册》将立克次体目分为 3 科，即立克次体科(Rickettsiaceae)、无形体科(Anaplasmataceae)和全孢菌科(Holosporaceae)[1-2]。立克次体科主要包括立克次体属(Rickettsia)、斑疹伤寒或莫氏立克次体(R.typhi)和东方体属(Orientia)；无形体科包括无形体属(Anaplasma)、埃立克体属(Ehrlichia)、埃及小体属(Eegyptianalla)、考德里体属(Cowdria)、新立克次体属(Neorickettsia)、沃尔巴克体属(Wolbachia)和客鲍体属(Xenohalioti)；全孢菌科包括全孢螺菌属(Holospora)[1-2]。

根据现有研究，病原体分离以及分子生物学、血清学证据表明中国至少存在10种立克次体病[3]，经蜱传播的斑点热群立克次体(Spotted fever group rickettsia，SFGR)主要包括西伯利亚立克次体(R.sibirica)、黑龙江立克次体(R.heilongjiangensis)、内蒙古立克次体(R.mongolotimonae)、虎林立克次体(R.hulinii)和日本立克次体等[4-5]。无形体病和埃立克体病是近年来发现的一类重要蜱传立克次体病，如引起人类疾病的人单核细胞埃立克体病(Human monocytic ehrlichiosis，HME)和人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasma，HGA)[6-8]。以上研究对我国蜱携带和传播的立克次体和埃立克体导致疾病的预防控制提供了重要的基础数据。

江西省地处中国大陆中东部，地理景观复杂，气候温暖，适宜多种吸血昆虫的滋生和繁殖。此前研究显示江西省存在多种蜱[9]，但是缺少蜱及其携带病原体关系的研究。2016年4月我们在江西省赣州市的龙南、安远、于都、崇义4个县采集蜱，进行蜱种类鉴定和蜱携带立克次体和埃立克体等病原体的调查研究，实验结果如下所述。

1 材料与方法

1.1标本采集 2016年4月12日至18日，在江西省赣州市龙南、安远、于都、崇义4县进行蜱的采集。放牧动物牛、羊等体表有蜱吸附，用镊子轻轻夹取，小心拔下，防止蜱头节断裂在动物皮肤内。手持白布旗在野外草地中拖拽布旗，行走50 m左右时，翻转布旗，查找布旗表面的爬行蜱，用镊子夹取，根据《医学蜱螨学》[10]在采集现场进行形态学鉴定分类后放入液氮冻存运回实验室待检测。

1.2立克次体和埃立克体基因提取和检测 蜱分批放入预冷的组织研磨器加入2 mL基础培养基(Minimal essential medium，MEM)清洗，弃去液体，再加入1mL含10%双抗MEM，研磨至组织碎片基本消失，取200 μL蜱的研磨混悬液，利用天根生化科技(北京)有限公司(中国)TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒(Cat.#DP304-03；Lot#Q5629)提取DNA。用表1中的引物RpCS877p/ RpCS1258n[11]和Eh-out1/ Eh-out2[12]扩增立克次体gltA基因和埃立克体16SrRNA基因。PCR反应体系为25 μL：ddH2O 9.5 μL，2×Dream Tag Green PCR Master Mix (Thermo)12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL。扩增条件：RpCS877p/ RpCS1258n为94 ℃ 5 min，95 ℃变性20 s，48 ℃退火30 s，60 ℃延伸60 s，共35个循环，4 ℃保存。Eh-out1/ Eh-out2为95 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。反应结束后，取2 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。DNAMarkerDL2000购自大连宝生物公司。

表1 本研究所用引物信息
Tab.1 Primer sequences for virus identification in this study

种类引物名称扩增片段/长度序 列参考文献立克次体RpCS877pgltA/381 bp5′-GGGGGCCTGCTCACGGCGG-3′[11]RpCS1258n5′-ATTGCAAAAAGTACAGTGAAC-3′埃立克体Eh-out116S rRNA/653 bp5′-TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG-3′[12]Eh-out25′-CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC-3′

1.3序列测定及分子遗传进化分析 阳性PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司昆明办事处完成测序。从GeneBank下载相关序列，包括不同国家、不同年代的立克次体属和埃立克体属的代表株。使用DNASTAR 软件包中的Seqman软件对测序结果进行拼接和质量分析；使用BioEdit(version 7.0.5.3)和ClustalX 1.8软件进行核苷酸和氨基酸序列的比对；使用Gene DOC软件进行核苷酸和氨基差异度分析；使用MEGA 5.05软件完成基于Neighbour-joining(NJ)方法的进化树绘制，Bootstrap值设定为1000[13]。

2 结 果

2.1标本采集和鉴定 本次调查在江西省赣州市的牛、羊等动物体表和草地上共采集蜱395只，其中龙南县201只、安远县16只、于都县160只和崇义县18只。按采集地点、时间和种类相同的蜱每5～13只为一批共分为43批标本。鉴定结果显示，赣州市龙南县2属3种蜱为血蜱属的长角血蜱、具角血蜱和扇头蜱属的微小扇头蜱；于都县2属2种蜱为微小扇头蜱和长角血蜱；安远县为微小扇头蜱；崇义县为嗜群血蜱(表2)。

表2 江西省赣州市4县蜱标本采集信息和PCR检测结果
Tab.2 Specimen collection and PCR detection of ticks in 4 counties of Ganzhou City, Jiangxi Province

序号采集地标本号种类数量宿主立克次体(gltA)埃立克体(16S rRNA)1龙南县LN1601长角血蜱12牛--2LN1602长角血蜱6牛--3LN1603长角血蜱8牛--4LN1604长角血蜱9牛--5LN1605长角血蜱7牛--6LN1606具角血蜱7牛日本立克次体-7LN1607具角血蜱5牛日本立克次体-8LN1608具角血蜱7牛日本立克次体-9LN1609具角血蜱10牛日本立克次体-10LN1610具角血蜱10牛日本立克次体-11LN1611具角血蜱10牛日本立克次体-12LN1612具角血蜱10牛日本立克次体-13LN1613具角血蜱10牛日本立克次体-14LN1614具角血蜱10牛日本立克次体-15LN1615具角血蜱10牛扇头蜱立克次体-16LN1616具角血蜱10牛日本立克次体-表2(续)序号采集地标本号种类数量宿主立克次体(gltA)埃立克体(16S rRNA)17LN1617具角血蜱10牛日本立克次体-18LN1618具角血蜱10牛日本立克次体-19LN1619微小扇头蜱10牛--20LN1620微小扇头蜱10牛马赛立克次体-21LN1621微小扇头蜱10牛日本立克次体-22LN1622微小扇头蜱10牛日本立克次体-23安远县AY1601微小扇头蜱5牛--24AY1602微小扇头蜱5牛--25AY1603微小扇头蜱6牛--26于都县YD1601微小扇头蜱10牛--27YD1602长角血蜱10牛--28YD1603长角血蜱10牛--29YD1604长角血蜱10牛--30YD1605长角血蜱10牛--31YD1606长角血蜱10草地-埃立克体32YD1607长角血蜱10草地--33YD1608长角血蜱10草地--34YD1609长角血蜱10奶牛--35YD1610长角血蜱10奶牛--36YD1611长角血蜱10奶牛--37YD1612长角血蜱10山羊--38YD1613长角血蜱10山羊--39YD1614长角血蜱10山羊--40YD1615长角血蜱10山羊--41YD1616长角血蜱10山羊--

注：表中“—”代表PCR实验结果为阴性。

2.2立克次体基因检测和分析 用立克次体属引物RpCS877p/RpCS1258n扩增gltA基因，结果显示，43批标本中获得17批阳性PCR产物，测序后将17株序列在GenBank中进行Blast，结果提示均属于立克次体科(表2)。选取不同种类的立克次体15株与本次实验获得的17株立克次体序列构建基于gltA基因(334 bp)的系统进化树，牛无形体(Anaplasmabovis)1株为外群。系统进化分析显示龙南县22批蜱中检测到16批阳性，来源于具角血蜱的LN1615株与扇头蜱立克次体处于同一分支，来源于微小扇头蜱的LN1620株与马赛立克次体处于同一分支，其余12株来源于具角血蜱和2株来源于微小扇头蜱与日本立克次体处于同一分支。崇义县CY1602株来源于嗜群血蜱与R.raoultii处于同一分支。安远县微小扇头蜱检测均为阴性(图1)。

注：带“▲”为本次实验测序所得序列。图1 立克次体gltA基因部分序列(334 bp)的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of 334 bp segments of Rickettsia gltA gene

2.3埃立克体基因检测与分析 用埃立克体属引物Eh-out1/Eh-out2进行PCR实验，结果获得1批阳性PCR产物(表2)。选取埃立克体属中的18株，包括了犬埃立克体(E.canis)4株、查菲埃立克体(E.chaffeensis)3株、伊氏埃立克体(E.ewingii)3株、鼠埃立克体(E.muris)2株和反刍动物埃立克体(E.ruminantium)3株，牛无形体1株作为外群，与本次实验获得的YD1606株构建基于16S rRNA基因(558 bp)的系统进化树，结果提示于都县YD1606株为来源于长角血蜱的埃立克体，与2010年日本长角血蜱中的Yonaguni206(HQ697589)、Yonaguni138(HQ697588)[14]和2009年韩国长角血蜱中的HLAE178(GU075695)[15]处于同一分支。

注：带“▲”为本次实验测序所得序列。图2 埃立克体16S rRNA基因部分序列(558 bp)的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of 558 bp segments of Ehrlichia 16S rRNA gene

3 讨 论

蜱隶属于节肢动物门(Arthropoda)、蛛形纲(Arachnida)、寄螨目(Parasitiformes)、蜱总科(Ixodoidea)，又分为3个科：硬蜱科(Ixodidae)、软蜱科(Argasidae)和纳蜱科(Nuttalliellidae)[10]。中国有硬蜱科约100种，软蜱科10种。我国东北部的大小兴安岭地区以全沟硬蜱(Ixodespersuleatus)为主，而我国南方地区嗜群血蜱多见[16-19]。根据邓国藩等[20]，陆宝麟等[21]，杨晓军等[22]，许红彬等[9]的文献报道，依据传统的形态学特征鉴定分类，江西省目前共有2科5属14种蜱。本研究中赣州市龙南县鉴定出蜱2属3种，为血蜱属的长角血蜱、具角血蜱和扇头蜱属的微小扇头蜱，种类最多；其次为于都县，鉴定出蜱2属2种为微小扇头蜱和长角血蜱；安远县为微小扇头蜱；崇义县采集的蜱为嗜群血蜱，嗜群血蜱此前在江西省未见报道，为当地蜱种的新纪录。

本次研究首次通过分子生物学方法对江西省赣州市西南地区4县捕获的蜱携带的立克次体和埃立克体病原体进行分子生物学检测，共获得4种立克次体和1种埃立克体。根据核苷酸序列的分子遗传分析显示，江西省赣州市蜱中携带的立克次体主要有日本立克次体、马赛立克次体、扇头蜱立克次体和R.raoultii，其中日本立克次体检出最多共14株，来源于龙南县采集的具角血蜱(12株)和微小扇头蜱(2株/LN1621和LN1622)，从分子生物学角度明确了具角血蜱、微小扇头蜱与日本立克次体的关系；还从龙南县的微小扇头蜱中检测到1株马赛立克次体(LN1620)和具角血蜱中检测到1株扇头蜱立克次体(LN1615)。崇义县的嗜群血蜱中检测到1株R.raoultii(CY1602)。

斑点热群立克次体是全球性分布的一类重要蜱传病原体，目前报道该病的国家和地区高达50余个，包括落基山斑点热、蜱传北亚热和日本斑点热等。目前已经发现并证实具有致病性的13个斑点热群立克次体中，我国存在的斑点热群立克次体有4种：西伯利亚立克次体、内蒙古立克次体、黑龙江立克次体和虎林立克次体[23-24]。

1985年到1986年内田孝宏在日本的四国地区病人血清中分离到一株日本立克次体，为斑点热群立克次体的一个新种，命名为日本立克次体[25-27]，能引起红疹热。此后2003年菲律宾[28]、2006年韩国[29]、2007年泰国[30]等国家分别在对本国国内发热病人血清进行立克次体感染状况的调查中发现存在日本立克次体感染，其中韩国得到了日本立克次体的分离株。我国1990-1999年，Feng Hui-min等[31]，林英姿等[32]在海南岛地区采集病人血清进行日本立克次体抗体检测及病原分离，结果显示1 030份血清[其中642份收集自海南岛东南部、中南部(五指山周边区)和北部(海口市)地区的人群血清]中检测有2份标本含有高滴度日本立克次体 IgG抗体 (≥ 1∶160)，日本立克次体 IgG抗体阳性率为2. 2%，遗憾的是并未分离到病原体。2017年Lu Miao等首次在武汉采集的褐黄血蜱(H.flava)、豪猪血蜱(H.hystricis)和中华硬蜱(I.sinensis)中检测出日本立克次体[33]。本次实验中江西蜱中有14株序列的分子遗传进化分析显示与日本立克次体KX987344、KX987349和DQ909073处于同一进化分支，提示这14株序列均为日本立克次体。这是首次在我国江西省采集的蜱中检测到日本立克次体基因阳性。本次研究中日本立克次体的阳性率为32.56%(14/43)均来自于龙南县。

本研究还从龙南县的微小扇头蜱中检测到1株马赛立克次体(LN1620)和具角血蜱中检测到1株扇头蜱立克次体(LN1615)；崇义县的嗜群血蜱中检测到1株R.raoultii(CY1602)。这3种立克次体均属于斑点热群立克次体[23]。近期的研究表明，R.raoultii是蜱致淋巴结病(Tick-borne lymphadenopathy，TIBOLA)的潜在病原体，其分布广泛，目前已从13个国家和地区的革蜱等10种蜱中检出[34]。本次研究从3种蜱中检测到4种立克次体，提示江西省蜱中立克次体具有多样性，该结果为研究当地存在的立克次体引起人类感染导致的相关疾病具有重要意义。

埃立克体是一类严格细胞内寄生的格兰阴性球菌，属于立克次体目、无形体科、埃立克体属[1-2]，蜱是埃立克体的主要传播媒介，可引起人或动物单核细胞埃立克体病、粒细胞埃立克体病、牛羊蜱传热、腺热埃立克体病等。本研究从于都县的长角血蜱中检测到1株埃立克体(YD1606)，与2010年日本长角血蜱中的Yonaguni206(HQ697589)、Yonaguni138(HQ697588)[14]和2009年韩国长角血蜱中的HLAE178(GU075695)[15]处于同一分支。与埃立克体属的犬埃立克体、查菲埃立克体、伊氏埃立克体、鼠埃立克体和反刍动物埃立克体均不在同一进化分支，可能是一种新的埃立克体，与Matsumoto K等在日本的研究结果一致[14]，但是其分子生物学特性还有待进一步深入研究。

综上所述，本次研究首次利用分子生物学方法对江西省赣州市4个县采集的蜱携带的病原体进行了分子遗传学分析，检测到4种立克次体和1种埃立克体，为今后开展蜱及其传播病原体的调研，了解病原体在当地疾病中的作用提供了根据。