衣原体致病机制的研究策略及挑战

衣原体作为严格胞内寄生的病原菌，其感染宿主遍及单细胞生物(阿米巴)、动物和人类[1]。目前已发现的对人类致病的衣原体有沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis，Ct)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophilapsittaci，Cps)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophilapneumoniae，Cpn)、流产嗜衣原体(Chlamydophilaabortus)等[1-2]。衣原体通过多种途径感染宿主，且感染部位多，临床病例以沙眼、呼吸系统及泌尿生殖系统疾病较为常见[2-3]。全面了解衣原体的致病机制，寻找有应用价值的分子靶标来有效预防和控制衣原体感染尤为重要。衣原体致病机制复杂，现存的基因改造工具效率低，基因操作比较困难，这很大程度上限制了对其致病机制的探索。本文主要从衣原体致病机制研究方法或研究策略的角度进行综述，为全面分析衣原体功能机制提供科学依据。

1 衣原体致病物质

目前发现的衣原体致病物质有黏附素(adhesion)、包涵体膜蛋白(Inclusion membrane protein，Inc)、衣原体蛋白酶样活性因子(chlamydial protease-like activity factor，CPAF)、尾特异性蛋白酶(the tail-specific protease，Tsp)、高温需要A蛋白(high temperature requirement protein A，HtrA)、衣原体分泌性蛋白、红细胞凝集素、脂多糖(lipopolysacharide，LPS)、巨噬细胞感染增强蛋白(MIP蛋白)等。衣原体感染形式原体(elementary body，EB)黏附于宿主细胞表面是致病过程至关重要的一步，EB表面各种蛋白可与宿主表面受体结合，其中最主要的有主要外膜蛋白[4](major outer membrane protein，MOMP)、衣原体外膜蛋白2[5](outer membrane protein，Omp2/OmcB)及多形态膜蛋白(polymorphic membrane proteins，Pmp)[6]等，介导衣原体粘附于宿主细胞表面，但其确切作用机制仍不清楚。

衣原体进入细胞后，于胞质内形成包涵体，并在包涵体中繁殖发育。包涵体不仅为衣原体繁殖提供微环境，而且保护衣原体免遭宿主免疫系统的的识别和清除。同时衣原体必须通过包涵体从宿主细胞中摄取营养以及信号的转换。Inc是包涵体主要组成成分，是衣原体基因编码、表达定位于包涵体上的蛋白质。在衣原体生长发育中Inc发挥重要作用[7]，但是与宿主细胞相互作用过程中的功能机制尚不清楚。另外，CPAF[8]、Tsp[9]、HtrA[10]、Pgp3[11]以及其它衣原体分泌性蛋白等在衣原体逃避宿主免疫识别、抑制NF-kB促炎信号通路、发挥水解蛋白活性、重组细胞骨架、抗宿主免疫等方面发挥重要作用，其具体功能机制仍待探究(表1)。

表1 衣原体致病物质及相关功能
Tab.1 Pathogenic substances ofChlamydiaand their related functions

致病物质功能粘附素(MOMP、OmcB、Pmp)通过与宿主细胞表面受体结合而参与致病[4-6]包涵体膜蛋白与高尔基复合体相关Rab GTP酶相互作用干扰宿主细胞能量代谢;促进包涵体膜融合;调控细胞周期[7, 11-13]衣原体蛋白酶样活性因子使衣原体免受T细胞B细胞的特异性识别;改变细胞周期和细胞骨架蛋白;在感染早期抑制凋亡[8, 14]尾特异性蛋白酶使NF-kB信号通路受阻从而抑制促炎细胞因子基因的转录[9]高温需要A蛋白 HtrA的PDZ区域可以调控蛋白酶活性[10]衣原体分泌性蛋白 (Tarp、CPAF)Tarp在细胞内被快速磷酸化,可能启动和参与调节肌动蛋白募集反应的信号转导[15]脂多糖维持EB特异性外膜蛋白稳定、表达和定位[16]巨噬细胞感染增强蛋白刺激衣原体感染细胞分泌促炎细胞因子[17]

2 致病机制研究策略

2.1比较基因组学和蛋白质组学(质谱分析)—寻找毒力因子、筛选差异表达蛋白 为了明确衣原体对人类和动物的致病机理，研究人员通过基因组学与蛋白组学对衣原体开展研究。基因组学是以生物体的全部基因为研究对象，对所有基因进行基因组作图，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学，以阐明生物基因组DNA中碱基对的序列情况，破译其遗传信息。 Russell[18]在体外竞争实验中发现了致病性减弱的衣原体菌株，对其进行基因组杂交发现减毒株tc0236基因的碱基置换，由此得出tc0236是参与衣原体致病的染色体基因。Chen[19]等将衣原体体外传代，获得了对小鼠生殖道致病率大大降低的减毒株，全基因组测序和比较基因组学分析发现TC0668是衣原体致小鼠生殖道病变的毒力因子。衣原体减毒株还可经紫外线或化学诱变剂如甲基磺酸乙酯(EMS)或乙基亚硝基脲(ENU)处理而获得。CtL2型菌株经EMS或ENU诱变后，全基因组测序比对出现84个开放阅读框(open reading frames，ORFs)的无义突变，通过构建对应的突变株细胞感染模型，发现CtORFs参与糖代谢、DNA损伤及毒性作用[20]。Ct多形态膜蛋白D(PmpD)是一种高度保守的自转运蛋白，Kari[21]等以制备的CtPmpD缺失株与野生株比较，发现CtPmpD缺失株接种的小鼠上生殖道其病理症状明显弱于野生组，从而发现pmpD的毒力作用。CPAF被认为是调控衣原体与宿主细胞相互作用关系的功能性蛋白酶，Snavely[22]等构建CPAF缺失的衣原体细胞感染模型，其子代衣原体呈现生长发育缺陷现象，揭示了CPAF在衣原体复制方面的重要调控作用。比较基因组学从全基因角度对物种的遗传与进化进行系统分析。对于物种间毒力丢失的研究，该方法可以快速鉴定物种间发生的所有突变，进而阐明毒力丢失的分子机制。

蛋白质是转录翻译后表达的产物，蛋白质组学是大规模研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，与比较基因组学相辅相成。基于前期得出的TC0668为毒力因子，研究人员可通过建立单基因差异型菌株细胞感染模型，iTRAQ相对定量蛋白质组学质谱分析筛选出致病相关分子及信号通路，基因敲除小鼠进行信号通路验证等，进一步揭示TC0668可能致病机制。Yang[23]等构建转录激活因子CtChxR突变株细胞感染模型，与未突变组相比，蛋白质组学分析有CT005、 CT214、 CT565、 CT694和CT695蛋白的表达明显下调，这5种蛋白归属于包涵体膜蛋白及三型分泌系统蛋白，表明ChxR是调节毒力基因表达的转录激活因子。同样地，对衣原体质粒基因pgp4的调控功能进行研究，建立pgp4单基因差异型菌株细胞感染模型，蛋白质组学分析突变组有CPAF表达下调，从而说明pgp4能够负向调节CPAF表达[24]。随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等进行研究，将直接阐明衣原体在生理或病理条件下的作用机制。

2.2从大肠杆菌原核表达系统、哺乳动物细胞真核表达系统到衣原体转化系统—靶基因功能研究手段的更新

2.2.1大肠杆菌原核表达系统 原核表达系统是目前掌握最为成熟的表达系统，大肠杆菌是常用的原核表达系统。构建衣原体目的基因的大肠杆菌表达系统，靶基因连同载体转入大肠杆菌，通过诱导表达、纯化获得目的蛋白。已知肽聚糖是一种细菌必需的糖/氨基酸聚合物，它由D-谷氨酸参与合成。大肠杆菌D-谷氨酸由谷氨酸消旋酶(Murl)基因编码产生，而在衣原体中却没有发现Murl的同源基因。结合前期研究结果，为了探索CtdapF基因拥有编码肽聚糖合成酶的功能，George克隆dapF基因通过pBAD18载体转化到Murl缺失的大肠杆菌中，结果使Murl缺失的大肠杆菌由缺陷生长发展为恢复正常生长，说明CtdapF基因编码活性的D-谷氨酸消旋酶[25]。Ct脂蛋白MIP(D541)对宿主细胞具有致病作用，Wang[26]通过建立大肠杆菌表达系统诱导Ct重组脂蛋白(D381、D541、D067、D775)表达，通过一系列检测项目发现Ct脂蛋白通过MyD88依赖信号通路诱导炎症反应的发生。构建原核表达重组体能够在较短时间内获得基因表达产物，且所需的成本相对较低，因此被研究人员大量采用。但原核表达系统表达产物的生物活性较低，而且衣原体基因转化到大肠杆菌系统中表达的蛋白并不一定是具有天然构象的目的蛋白，不能真正反映目的基因在衣原体致病过程中所参与的功能。

2.2.2哺乳动物细胞真核表达系统 建立稳定表达外源基因的真核细胞模型，是研究基因的功能、细胞内表达的蛋白定位的重要途径。真核细胞表达系统是将目的基因经PCR扩增，利用合适载体转染至真核细胞(一般是哺乳动物细胞)。衣原体编码特异性酶CT149参与脂代谢，Peters[27]将ct149基因转染至人宫颈癌上皮细胞，细胞内的胆固醇酯类表达水平明显下降，表明CT149具有胆固醇酯酶活性，并且很有可能对真核细胞胆固醇酯水解产生作用。Vromman[28]前期利用酵母双杂交初步筛选到衣原体蛋白CT619的相互作用蛋白为宿主蛋白Tsg101。研究者将携带标签的Tsg101基因载体与ct619基因载体共转染于真核HEK-293T细胞,免疫共沉淀实验验证两者为互作蛋白。真核表达系统构建了稳定表达外源新基因的细胞系,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明衣原体的致病机制、疫苗研制等提供有利的条件。但是利用细胞基因工程技术表达外源蛋白， 技术复杂，成本较高，难以满足大规模的实际应用。

2.2.3衣原体转化系统 目前存在的衣原体转化系统包括水平基因转移(lateral gene transfer，LGT)、TargeTron、FRAEM及CRISPRi等。LGT[29]是由质粒介导遗传物质在同源或异源物种之间传递。Wang[30]等将转化外源基因的方法应用到衣原体转化系统，即向L2型Ct稳定转化相应的pL2质粒载体。 Agaisse[31]等成功构建GFP、mCherry、青色荧光蛋白基因的重组质粒，实时观察到衣原体目的蛋白在宿主细胞中的定位。质粒编码Pgp1-Pgp8八个质粒蛋白及一个非编码小RNA。由于临床分离的自然无质粒株非常少见，有质粒菌株在体外实验和动物模型中，显出与无质粒株明显不同的毒力和感染后果，提示质粒与衣原体的致病性密切相关[32]。研究者分别构建pgp3缺失转化株、pgp5缺失转化株与鼠衣原体(Cm)质粒完整株的小鼠生殖道感染模型，与质粒完整株相比，pgp3、pgp5缺失转化株其小鼠输卵管水肿程度明显下降，表明pgp3和pgp5是致上生殖道病变的致病因子[11, 33]，且pgp3也是Cm由生殖道传播到胃肠道的作用因子[34]， Liu等利用构建的pgp5缺失转化株揭示Cmpgp5抑制某些质粒依赖基因的表达[35]。Michael[24]和Song[36]利用穿梭载体构建pgp4差异型菌株细胞感染模型，联合蛋白质组学结果揭示pgp4正向调节pgp3及染色体基因表达，负向调节CPAF表达。

除了质粒可以作为载体携带外源基因外，TargeTron技术[30]将可移动II 型内含子作为目标基因的载体， Fisher[37]、Weber[7]等应用TargeTron技术成功构建多种inc基因缺失衣原体的细胞感染模型，出现了包涵体提前裂解和宿主细胞死亡现象，表明包涵体膜蛋白对衣原体生长发育的重要支持作用。而FRAEM技术[38]是利用DNA同源性，在保持基因组完整性情况下向衣原体基因组区域靶向插入基因使目标基因沉默或者发生等位基因交换。该技术同样应用于靶向衣原体基因组插入GFP基因，光学显微镜下动态观察目的基因的表达和定位。Mueller[38]等利用此方法使CtL2型菌株trpA基因缺失并由编码GFP和β内酰胺酶的基因表达，这也成为操纵衣原体的重要突破。Ouellette[39]描述了CRISPR干扰技术(CRISPRi)来诱导/抑制衣原体基因表达的方法。CRISPRi已经被成功应用在大肠杆菌及结核分枝杆菌上，Ouellette首次将此技术应用在抑制衣原体包涵体膜蛋白基因incA的表达，实现了由CRISPRi引起的衣原体基因敲除。基因转移系统研究衣原体质粒及染色体基因组所编码产物的生物学功能， 为阐明致病机制提供了可行性方案。一系列研究成果表明基因转化系统在推动衣原体致病机制研究进展方面具有举足轻重的地位。

2.3酵母双杂交、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)、GST Pull down—寻找相互作用蛋白

2.3.1酵母双杂交 核酸是生命体的遗传物质，而蛋白质是生命活动的物质基础，核酸与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间存在着交互作用，而这种交互作用决定生命体的代谢发育活动。蛋白质相互作用研究技术主要有酵母双杂交、免疫共沉淀、GST Pull down等。衣原体分泌效应蛋白干预宿主细胞代谢发育，而衣原体基因编码的4～5个效应蛋白共享未知功能区域DUF582。 Vromman[28]利用酵母双杂交系统寻找衣原体DUF582蛋白的相互作用蛋白。研究者克隆DUF582基因，融合到酵母载体pGBKT7的GAL4 DNA结合结构域，克隆Hrs基因融合到pGADT7的转录激活结构域，两类载体转化于酵母菌AH107，通过报告基因功能筛选到DUF582蛋白CT619的相互作用蛋白为宿主蛋白Tsg101，而且二者在细胞内的ESCRT结构结合，参与宿主细胞膜收缩过程。同样，Lutter和Mital[40]等利用酵母双杂交系统得出包涵体膜蛋白CT228、CT850分别与肌球蛋白磷酸酶亚基MYPT1、动力蛋白轻链DNYLT1具有相互作用关系，为包涵体在微管组织中的定位提供更深层次的认识。

2.3.2GST pull-down GST pull-down是行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。衣原体Scc4蛋白(CT663)是T3S的伴侣蛋白且也是RNA聚合酶抑制剂。Hanson[41]等将Scc4，T3S伴侣蛋白Scc1和T3S亚基 CopN分别利用相应载体转化到酵母菌，pulldown实验探究两种蛋白之间关系。结果发现Scc4的表达导致其它基因转录水平下降，说明Scc4可能是连接T3S的桥梁。同样，Lorenzini[42]通过Pulldown 捕捉到沙眼衣原体蛋白CT670与三型分泌系统蛋白CT671的相互作用关系。Pull-down试验其“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

2.3.3免疫共沉淀(Co-IP) 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，可以确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的关系。Vromman[28]通过共沉淀方法对酵母双杂交结果进行验证，确认了DUF582蛋白CT619与宿主蛋白Tsg101存在相互作用关系。Zhao[43]同样应用免疫共沉淀法验证肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0147与宿主蛋白CREB3具有相互作用关系，这也印证了衣原体包涵体膜蛋白与宿主细胞质之间的某种联系。免疫共沉淀得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

2.4构建动物模型—衣原体的致病机制研究及其防治的重要平台 动物模型已成为现代生物医学研究中极其重要的实验方法和手段，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律和防治措施研究。衣原体毒力因子致病性均通过动物实验来验证，而选择合适的动物模型也是致病机制研究的关键一步。灵长类动物在解剖、生理、免疫系统方面与人类相似并且能够被沙眼衣原体人类血清型感染，是较理想的沙眼衣原体感染模型。但其价格较昂贵并且数量稀少，因此很难被应用。小鼠体积较小，容易操作，价格低，并且针对小鼠的相关生化试剂较易获得，这使得小鼠模型成为研究生殖道沙眼衣原体感染应用最多的模型[44]。沙眼衣原体分离株均来自人类，小鼠本身的固有免疫机制可能导致对沙眼衣原体不易感而导致感染小鼠后很快被机体清除，无法在小鼠模型上对沙眼衣原体致病作用进行后续的研究。也有可能是衣原体处于选择压力下的体外增殖，造成其毒力基因的丢失，无法通过动物实验去验证致病作用。Cm与Ct的具有高度同源性，通过Cm感染小鼠建立生殖道感染模型能够替代研究Ct的致病机制。因此，实验室常用Cm感染小鼠建立感染模型进行沙眼衣原体致病机制的研究[45]。

动物实验是衣原体研究的重要实验基础。LEi[32]即是通过建立质粒差异型衣原体的小鼠感染模型，验证了衣原体质粒的致病性，为进一步分析质粒基因致病性奠定基础。同时动物实验还为衣原体疫苗校检提供有效途径，Connell[46]将质粒缺失衣原体接种小鼠，在接种质粒完整衣原体后检测到小鼠血清有保护性抗体且未出现明显的生殖道病变，以此判断衣原体质粒缺失株作为衣原体减毒活疫苗是否发挥保护性免疫作用。

3 生物学意义

近几年，生物学技术的发展使衣原体致病机制的研究有了突破性进展。比较基因组学和蛋白质组学成为筛选毒力因子的有效手段。蛋白相互作用技术是寻找互作蛋白的重要途径，是衣原体致病机制研究历史上重要的里程碑。衣原体转化系统的应用将衣原体基因致病作用的神秘面纱逐渐揭开。当然，分子生物学技术仍存在缺陷与不足。因此，在选择表达系统时，应充分考虑各种因素、各种蛋白表达系统的优缺点，权衡利弊，做出最佳判断和选择。基因/蛋白表达系统的更新是人类对事物发现和创新能力的提高的必然结果，相信未来所有表达系统也会在功能上得到进一步的改善。动物感染模型能贴切地表达衣原体感染生殖道的病理反应，而选择合适的动物模型也是衣原体致病机制研究方向上不可或缺的基石。未来，对相关分子生物学技术的探索将是加速衣原体致病机制研究进程的必经之路。