鲍曼不动杆菌诱导Raw 264.7细胞自噬研究

DinshKumarK,吴亮姜旭淦阴晴陈盛霞许化溪

鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)是一种临床常见的革兰阴性杆菌，是引起医院内感染的主要病原菌，常引起ICU、脑外科和呼吸内科等病区暴发感染[1]。近年来，鲍曼不动杆菌耐药性升高迅速，多重耐药菌和泛耐药菌分离率逐年上升[2]。目前我国临床多重耐药鲍曼不动杆菌检出率已经超过铜绿假单胞菌，居革兰阴性菌中首位，有“革兰阴性MRSA”之称[3-4]。

自噬是广泛存在于真核细胞中的一种特殊的死亡现象，其本质是细胞吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并将其包被进入囊泡中，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，以降解其所包裹的内容物。因此自噬不仅可以清除细胞内受损、老化细胞器以及错误折叠蛋白质，还可以在早期清除侵入细胞的病原微生物[5]。而近年来，自噬在哺乳动物抵抗病原体感染中所发挥的作用越来越引起人们的研究兴趣，现已发现多种病毒、细菌、真菌和寄生虫可以诱导哺乳动物细胞发生自噬现象[6-7]。

在人体细胞中巨噬细胞是抵御病原体入侵的“第一道屏障”，可以在病原体侵入早期发挥吞噬清除作用。在各种病原体感染过程中，如果仅诱发人体巨噬细胞发生有限自噬可以帮助机体清除侵入的病原体并防止感染扩散，但当巨噬细胞发生无限制自噬时，则会导致患者抵抗力下降无法有效清除侵入的病原体，进而造成感染范围扩大并导致严重后果[8-9]。鲍曼不动杆菌是一种常见临床致病菌，目前尚无该菌诱导巨噬细胞自噬的研究报道。本研究探讨了鲍曼不动杆菌诱导鼠巨噬细胞自噬能力及机制，现将结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1菌株和细胞 鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC17978由本课题组保存。鼠巨噬细胞Raw 264.7购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，由本课题组扩增培养后于液氮中大量冻存，取复苏后3～7代细胞用于后续实验。

1.2实验试剂 RPIM 1640细胞培养液购于南京培源生物科技有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国GBICO公司，细胞培养级胰蛋白酶购自美国HyClone公司，血琼脂平板购于郑州安图生物有限公司，酵母提取物和胰蛋白酶均购于OXOID公司，LC3抗体和Beclin-1抗体购自美国Cell Signaling Technology(CST)公司，羊抗兔IgG抗体购自美国ABclone公司，RIPA裂解液购自南通碧云天公司，细胞总RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，反转录试剂盒和qPCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，PVDF膜(0.45 μm)和ECL曝光液购自美国Millipero公司，细胞培养耗材购自广州洁特公司，其他试剂均为国产分析纯，PCR引物参考相关文献由苏州泓讯生物科技有限公司合成(见表1)[10-12]。

表1 目的基因引物序列及长度
Tab.1 PCR primers and the length of PCR products

基因引物序列(5′-3′)长度/bpatg5F:CTTGCATCAAGTTCAGCTCTTCC R:AAGTGAGCCTCAACCGCATCCT107atg7F:CCTGTGAGCTTGGATCAAAGGCR:GAGCAAGGAGACCAGAACAGTG147atg12F:GAAGGCTGTAGGAGACACTCCTR:GGAAGGGGCAAAGGACTGATTC157ULK1F:CAGTCACCCACCCAGTTCCAAR:CCTCCACCCAGAGCATCTTCC152GABARAPL1F:TATCGGAAAAAGGAAGGAGAAAR:CAACAGTAAGGTCAGAGGGCAC136atg3F:GTCCCTTATTAGAGAAACTGTATR:AGAATATGACTACACAAGACACT147atg4BF:AGGTGCTAACACGGGGCTR:CGGGAGGCCTTACTGCTT134atg16L1F:GTCAGGCCTTATCACACTCTCCR:CAGAACCTCTCTCCCTGTCC146β-actinF:CATTGCTGACAGGATGCAGAAGGR:TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG138

1.2细胞和细菌传代培养 Raw 264.7细胞培养于含15% FBS的RPMI 1640培养液，当细胞生长融合至70%时，以0.25%浓度胰蛋白酶消化收集细胞，6孔细胞板中每孔接种1×106个细胞并继续置于37 ℃ 5% CO2条件下培养24 h用于后续研究。保存于15%脱脂牛奶中鲍曼不动杆菌于血琼脂平板上四区划线生长，经37 ℃培养12 h后挑取单个菌落接种于3 mL LB液体培养基中，以200 r/min振荡培养10 h后离心收集细菌。细菌以pH 7.2无菌磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline, PBS)洗涤3次，再以PBS缓冲液重悬至OD600=1备用。

1.3细菌-细胞共培养 按细菌数量:细胞数量(multiplicity of infection, MOI)=10∶1比例将鲍曼不动杆菌和Raw264.7细胞共培养，同时设未感染细菌对照组。于感染30 min时加入终浓度100 μg/mL庆大霉素杀死未进入细胞内细菌，以无菌PBS缓冲液洗涤2次彻底除去游离细菌，继续培养至180 min时中止实验，收集培养物用于后续研究。整个实验重复3次。

1.4Western blotting法检测 RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白用于Western blotting法检测。总蛋白样本通过SDS-PAGE电泳分离，经350 mA恒流转印至PVDF膜。LC3抗体和Beclin-1抗体均以1∶1 000倍稀释后4 ℃孵育过夜。次日以TBST缓冲液洗涤3次，每次10 min。羊抗兔IgG经1∶2 000倍稀释后室温孵育1 h。在PVDF膜上滴加适量ECL曝光液，显影并记录。

1.5qPCR法检测 严格按照百泰克公司细胞总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，并反转录为cDNA用于qPCR检测。qPCR反应条件是95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，共40个循环。记录目的基因与内参的CT值，将目的基因与内参基因比较后再与对照组比较，计算atg mRNA相对表达量。

1.6统计学分析 使用SPSS16.0统计学软件，采用Students’ t法分析感染组和正常组细胞基因和蛋白表达差异，P<0.05时差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Raw264.7细胞自噬相关基因表达 感染鲍曼不动杆菌180 min时，感染组细胞atg5、atg7、atg12、ULK1、GABARAPL1、atg3、atg4B和atg16L1基因表达量与对照组无统计学差异(F(atg5)=0.9918；F(atg7)= 0.9697；F(ULK1)= 0.9871；F(GABARAPL1)=0.8585；F(atg3)=0.9662；F(atg4B)=0.7181；F(atg16L1)=0.7794，P>0.05)，仅atg12基因表达量高于对照组(F=208.6，P<0.01)(见图1)。

**：P<0.01图1 Raw264.7细胞自噬相关基因表达Fig.1 Autophagy related genes expression in Raw 264.7 cells

2.2Raw264.7细胞LC3和Beclin-1蛋白表达 感染鲍曼不动杆菌180 min时，感染组细胞LC3和Beclin1蛋白表达量均高于对照组(F(LC3)=457.2；F(Beclin-1)=43.27，P<0.01)(见图2)。

**：P<0.01图2 Raw264.7细胞自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达Fig.2 Autophagy related proteins LC3 and Beclin-1 expression in Raw 264.7 cells

3 讨 论

鲍曼不动杆菌是引起院内感染暴发的重要病原菌，常引起肺部感染，而肺部巨噬细胞在抵御和清除鲍曼不动杆菌感染中发挥重要作用。巨噬细胞吞噬鲍曼不动杆菌后，可形成吞噬囊泡结构，并与溶酶体融合形成自噬相关溶酶体，启动细胞自噬进而杀灭侵入的鲍曼不动杆菌[13]。通过启动被感染细胞自噬可以杀灭侵入细胞的各种病原微生物，防止感染的进一步扩散。多种病原体已被证实可以诱发宿主巨噬细胞自噬，目前尚未见鲍曼不动杆菌诱导巨噬细胞自噬的研究报道[14-18]。

近些年的研究成果表明患者自噬发生程度与病原体致病力关系密切[6, 19]。鲍曼不动杆菌所引起患者呼吸道严重感染可诱发脓毒血症，其临床病死率极高[20]。在脓毒血症中，细菌感染诱发巨噬细胞发生不可控自噬或，大量巨噬细胞的自噬可以释放过量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，在杀灭侵入病原体的同时，也会造成患者肺正常组织损伤，并进一步导致肺功能的衰竭，这是造成患者死亡重要原因之一[21]。我们的研究结果表明，鲍曼不动杆菌的感染可诱导Raw 264.7细胞自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达量增高，提示鲍曼不动杆菌能够诱导Raw 264.7细胞发生自噬。通过qPCR法进一步研究发现，鲍曼不动杆菌感染可上调Raw 264.7细胞atg12基因表达量。ATG7-ATG4-ATG 8和ATG12- ATG7- ATG5是2条经典的自噬信号传导通路，2条自噬途径均依赖于Beclin-1蛋白的表达(ATG6)。综合我们的研究结果，我们推测鲍曼不动杆菌可以通过ATG12- ATG7- ATG5途径诱导Raw 264.7细胞自噬，但其具体机制仍有待于进一步研究。