针刺预处理“极泉”与“内关”穴对房颤大鼠房颤持续时间和Cx40蛋白及mRNA表达的影响

王 桓，程 凯，任 杰，李昱颉，游 敏，吴娇娟，林 怡，彭 超，古春凌，杨守亲

(北京中医药大学，北京 100029)

腧穴特异性是指腧穴相对于他穴或非穴所具有的形态结构，从而反映疾病及治疗效应上的相对特异性，是当代针灸界研究的方向与热点，本实验主要选择极泉和内关两穴进行研究。《类经》中记载:“手少阴，心经也；手厥阴，心包络经也；经虽分二，藏实一原；凡治病者，但治包络之腧，即所以治心也，故少阴一经，所以独无腧焉。” 从所主病候来讲，心包经和心经都常用于治疗心、胸和本经循行部位病症等，为治疗心脏疾病的高频经脉，均可作为治疗心系疾病的首选。内关穴作为治疗心血管类疾病疗效最为突出的穴位之一，据古代文献记载，已成为心包经中使用频率最高的穴位[1]，而对心经上腧穴治疗心系疾病的研究却相对较少。极泉穴为心经脉气所发，《外台秘要》载:其“心痛, 渴而欲饮，为臂厥，是主心所生病者”，可作为心经的代表穴位。心房颤动(Atrial fibriilation，Af)是最常见的心律失常之一，因此本实验借助阵发性房颤大鼠模型，采用针刺预处理双侧“极泉”穴，与“内关”穴治疗后的房颤持续时间进行对比，同时探讨“内关”和“极泉”穴对房颤结构重构的作用机制，以此为两穴的腧穴特异性研究提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

体质量180～200 g的雄性清洁级健康Wistar大鼠40只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2016-0011。实验前于北京中医药大学实验室(恒温恒湿SPF级)适应性喂养1周，每笼6～8只分笼饲养，自由进食进水。

1.2 试剂

氯化钠注射液(江西科伦药业有限公司，C18060606)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，30037517)；氯化乙酰胆碱(Ach，Bioruler，RH32383-5g)；无水氯化钙(Calcium chloride anhydrous，Bioruler，RH45167-25G)；Cx40(Abcam，ab183648)；Marker(Bio-rad，161-0374)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZB-2301)。

1.3 仪器

无菌针灸针(苏州环球针灸医疗器械有限公司，0.20 mm×13 mm)；哺乳动物类手术器械一套；BL-420S生物信号采集与分析系统(成都泰盟科技有限公司)。蛋白检测实验仪器：稳压稳流电泳仪(Bio-Rad，Powerpac HQ)；垂直电泳槽(Bio-Rad，MP3)；半干转电转印仪(Bio-Rad，Trans-Blot SD)；计算机图像分析仪(Image-Pro Plus Analysis Soft ware)；常温高速离心机(eppendorf，5417C)；4℃低温高速离心机(Thermo，MR 23i)；紫外分光光度计(eppendorf,Biophotometer)；微量加样器(eppendorf Research plus)。Real time PCR实验仪器：Real-Time PCR仪(ABI 7500)；数码凝胶成像系统(BINTA)。

2 方法

2.1 实验分组

将体质量均衡的大鼠用随机数字表法进行随机分组，分成正常组、模型组、内关组和极泉组共4组，每组10只大鼠。

2.2 腧穴定位

腧穴定位根据大鼠的形态和解剖结构特点，参照《实验针灸学》穴位标准定位如下。内关：穴位位于前肢内侧，距腕关节约3 mm左右的尺桡骨缝间；极泉：穴位位于腋窝顶点，腋动脉搏动处。

2.3 模型制备

采用阴茎经脉注射Ach 66 μg/mL+CaCl210 mg/mL混合液(1 mL/kg，当日新鲜制备)进行造模，以心电图出现典型Af改变者为造模成功，剔除造模前及造模过程中心电图已出现异常、注射中死亡或造模未成功的大鼠。正常组经阴茎经脉注射生理盐水(1 mL/kg)，模型组经阴茎经脉注射造模液，内关组和极泉组在进行针刺预处理后经阴茎经脉注射造模液。上述每组各10只大鼠，每日注射1次，连续7天进行造模。

2.4 处理方法

随机称重各组大鼠，后计算其造模液注射量并于当日新鲜配置。正常组：予捆绑20 min后麻醉，经阴茎经脉注射生理盐水；模型组：予捆绑20 min后麻醉，经阴茎经脉注射造模液造模；内关组：以0.20 mm×13 mm规格无菌针灸针直刺双侧内关穴；极泉组：以0.20 mm×13 mm规格无菌针灸针直刺双侧极泉穴，以针柄可见轻颤为度。两组针刺预处理组均行针1 min，以30 r/min轻微捻转，10 min后行针第2次，共留针20 min，每日1次，共7天，针刺预处理结束后麻醉，经阴茎经脉注射CaCl2-Ach混合液进行造模。

2.5 大鼠房颤持续时间记录

将处理结束后的大鼠以5 mL/kg腹腔注射7%水合氯醛进行麻醉，待大鼠昏迷将其仰卧位固定于桌面，用针形电极刺入已消毒的四肢，描记大鼠正常心电图后(记录标准肢体导联)见图1，经阴茎静脉以1 mL/kg注射CaCl2-Ach混合液。心电图以P波消失且出现典型的f波为房颤发生标志，以f波消失、P波出现恢复窦性心律为房颤终止,见图2，记录每日房颤持续时间。

图1 正常大鼠心电图

图2 造模后房颤大鼠心电图

2.6 大鼠心房肌Cx40蛋白表达检测

2.6.1 蛋白提取及定量 将心房肌组织从液氮取出，于预冷的研钵中快速研磨成粉末。将50 μL细胞裂解液加入预冷EP管，放入组织粉末，冰上孵育20 min后以4℃ 10 000 r/min离心10 min。将上清移至另一预冷的EP管中，BCA法测定蛋白含量后，将剩余蛋白样品加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水中煮5 min。

2.6.2 Western blot实验 ①配制10%SDS-PAGE分离胶溶液，加入5%浓缩胶,取40 μg 蛋白量的组织总蛋白样品及蛋白质分子量Marker，按1∶4体积比加入5×样品缓冲液，以1×样品缓冲液配平上样体积后，沸水浴5 min;②电泳初始电压为80 V，待溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至100 V，至溴酚蓝泳出分离胶下缘结束;③采用半干电转移仪进行蛋白质的电转移，恒流30 mA，电转90 min;④5%TBS-T脱脂奶粉封闭，室温振荡60 min;⑤一抗孵育(稀释比例1∶2 000);⑥二抗孵育(稀释比例1∶2 000);⑦PVDF膜置ECL混合液中于室温下振荡温育5 min，置于X光片盒中感光显影;⑧用IPP软件对扫描图象的目的条带进行灰度分析。

2.7 大鼠心房肌Cx40 mRNA表达检测

2.7.1 总RNA提取 目的基因RT-PCR的检测引物见表1。

表1 引物序列

2.7.2 反转录 将RNA 5 μL、Oligo(dT)2 μL、dd H2O(DEPC处理)4.5 μL加入离心管中，先42℃孵育60 min，后70℃孵育10 min。

2.7.3 RT-PCR 将cDNA 2 μL、引物1(10 pmol/μL)0.5 μL、引物2(10 pmol/μL)0.5 μL、SYBR mix 10 μL、dd H2O 7 μL同所得的cDNA一起加入离心管中混匀。Real-Time PCR程序设置为94℃预变性10 min，(94℃ 15 s，60℃ 60 s)×35个循环，72℃ 10 min。

2.7.4 PCR产物分析 用相对定量2-ΔΔCT分析法计算各个样本目的基因的表达变化。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠房颤持续时间比较

大鼠连续注射造模液7天后，与正常组比较，模型组大鼠房颤持续时间显著延长(P<0.01)；与模型组比较，内关组、极泉组大鼠的房颤持续时间均缩短(P<0.01)。见表2、图3。

表2 造模7天后各组大鼠房颤时间比较

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。图3 造模7天后各组大鼠房颤时间比较图

3.2 各组大鼠心房肌Cx40蛋白表达结果比较

与正常组比较，Cx40蛋白在模型组表达增高(P<0.01);与模型组比较，大鼠经过1周针刺预处理后，Cx40蛋白表达水平在内关组、极泉组均下调(P<0.01)。见表3、图4～5。

表3 各组大鼠心房肌Cx40蛋白相对表达量比较

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。

注：与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。图4 各组大鼠心房肌Cx40蛋白相对表达量比较图(n=3)

图5 Western blot检测各组大鼠心房肌Cx40蛋白条带

3.3 各组大鼠心房肌Cx40 mRNA表达结果比较

各组大鼠心房肌Cx40 mRNA相对表达量见图6，结果显示，正常组、模型组、经过1周针刺预处理的内关组和极泉组，各组间无显著差异。

图6 各组大鼠心房肌Cx40 mRNA相对表达量比较

4 讨论

房颤是最常见的心律失常之一，几乎可在所有的器质性心脏病中发生。目前认为,房颤是多种机制共同作用的结果，其中以Wijffels在1995年提出的“房颤引发房颤”的心房电重构和“第二因子学说”心房结构重构为参与房颤过程的主导理论[2]。心房的结构重构主要表现在房颤过程中心房肌的纤维化影响了心房肌缝隙连接蛋白(connexin，Cx)的表达量和分布，造成细胞间电信号传导通路受阻，房颤易感性增高[3]。相关研究证明，Cx40蛋白表达量和Cx40 mRNA转录水平的上调是心房结构重构过程中的主要参与者，可促进折返的发生[4-5]。

本实验结果显示，经过1周造模后，模型组的Cx40蛋白表达量较正常组明显升高，说明房颤的发生机制确与缝隙连接蛋白Cx40的表达水平有关；与模型组比较，内关组和极泉组的Cx40蛋白表达量下调，体现了针刺预处理对房颤发生的拮抗作用。但在对Cx40 mRNA转录水平的探究中，各组结果并无显著差异，说明房颤大鼠Cx40蛋白在基因层面的表达变化不明显。从房颤持续时间的比较来讲，大鼠连续注射造模液1周后，与正常组比较，模型组大鼠房颤持续时间显著延长，说明造模成功；与模型组比较，内关组、极泉组大鼠的房颤持续时间均缩短，说明极泉穴与内关穴在房颤的发生中均起到防治作用。值得一提的是，本实验对常用的经尾静脉注射Ach 66μg/mL+CaCl210 mg/mL混合液诱发大鼠房颤的造模方式[6]进行了操作上的改善，在造模液配制方法及剂量不变的情况下改经阴茎经脉注射后，造模效果与原方案无差异，操作流程上相对更简便。

临床及实验研究表明，针刺疗法在房颤的治疗中疗效显著，相对于单纯的药物治疗如胺碘酮更优[7-8]，被患者普遍认可接受。本实验所采用的针刺预处理手段，即在发病前施用针刺治疗，体现了中医“治未病”的预防医学理念。现代临床及实验研究均证实，预先针刺可以达到阻抑随后疾病对机体组织器官损伤的作用[9-11]。而在心律失常领域中，对于针刺预治疗房颤的疗效迄今鲜有人涉足，房颤的发生往往突发无征兆性，因此本实验的设计对于充分发挥针刺在防治房颤中的作用将大有裨益。且针灸治疗房颤具有价格低廉、操作安全简捷等优点，有重要的临床应用价值，值得被进一步推广。

内关穴为手厥阴经之络穴，又是八脉交会穴之一，根据《针灸甲乙经》描述“心系实则心痛,虚则为烦心,取之两筋间；心惮惮而善惊恐，心悲，内关主之”，主治心痛、心悸，有宁心、安神、定悸。亦有大量现代临床和实验研究证明，内关穴在降低心率、恢复节律方面有正向调节作用，在治疗房颤时有较显著疗效[12-14]。而选择心经的极泉穴与心包经的内关穴进行疗效对比，一方面是基于“经脉所过，主治所及”“宁失其穴，勿失其经”的针灸基础理论；一方面则是欲从极泉穴的近治作用与内关穴的远治作用角度进行腧穴特异性的比对分析。相对内关穴而言，对极泉穴的研究在古籍经典及现代实验中都较少，与此穴居腋窝处不便于临床进行针刺治疗或许有关。然《灵枢·邪客》曰:“人有八虚……以候五藏……肺心有邪，其气留于两肘；肝有邪，其气留于两腋……凡此八虚者，皆机关之室，真气之所过，血络之所游。”极泉位于腋下，是八虚之一，为气血运行的重要枢纽，其疗效不可忽视。本实验结果表明，极泉穴防治房颤的效果与内关穴相当，且临床已证实极泉穴具有改善心肌供血量[15]、缓解急性心绞痛[16]等作用，因而极泉穴治疗心系疾病的作用机制有待现代医学做出进一步的研究。

基于对内关与极泉穴的疗效分析，可以对心包经和心经的关系做进一步的探讨。从经脉循行的角度看，两者的循行路线有着惊人的相似性；从两经上的穴位来看，数量相同，均为9穴；同节段穴位主治相近，如上臂近肩部手少阴经的极泉与手厥阴经的天泉均擅长治疗心痛；如前臂腕部手少阴经的神门与手厥阴经的大陵均擅长治疗失眠怔忡等神志问题。因此可以推测，心经和心包经，实为一经[17]。古代文献中有相关理论支撑，如六朝时《产经》所载“手心主脉图”中仍称“心主者，内属于心”,且《太素·本输》卷十一有言:“心出中冲……溜于劳宫……注于大陵……行于间使……入于曲泽……手心主经也”，其中的中冲、劳宫、大陵、间使和曲泽现为心包经五腧穴；现代研究亦表明，心经与心包经相关区域感觉神经元的节段分布心脏感觉神经元节段分布有重叠现象[18]，结合本实验结果，也许可以为心经和心包经同属一经的猜想提供论证依据。

综上，本实验结果表明，针刺预处理极“泉穴”与“内关”穴在缩短房颤持续时间的效果相当，其机制可能与下调房颤大鼠心房肌心房缝隙连接蛋白Cx40的表达有关，但并未影响到基因层面的表达。本实验旨在为房颤的临床防治手段提供针刺治疗新思路，并期未来对极泉穴的腧穴特异性、心经及心包经两经从属关系的研究有进一步深入的探索。