2013—2018年广东省广州市某家禽批发市场禽流感病原学监测

朱建翠，何日文，沈 丹，张海冰，陈裕华，王 令，杨建宇，邹梦佳，陈 裕，钟卓玲

（广州市动物卫生监督所，广东广州 510440）

禽流感是指由禽流感病毒引起的一种禽类传染病，可以引起禽类呼吸器官或全身性感染。根据病毒的外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，禽流感病毒可分为16个HA亚型和9个NA亚型。2013年3月，上海、安徽首次报导3例人感染H7N9流感病例。研究发现，活禽市场是禽流感病毒的重要储存库[1]，也被认为是人感染H5N1、H7N9等禽源流感的高风险区域[2-3]。而家禽批发市场由于聚集了大量不同种属、不同产地、不同健康状况的活禽，因而为禽流感病毒的重组和跨种传播提供了有利条件[4]。为掌握广州市家禽批发市场中的家禽禽流感病毒携带状况和市场环境中的禽流感病毒污染情况，2013年以来，广州市动物卫生监督所制定监测计划，持续对辖区内家禽批发市场进行禽流感监测。本文对2013—2018年广州市某家禽批发市场的禽流感监测数据进行汇总分析，以期为了解广州市家禽批发市场的禽流感流行特点，预警疫病流行趋势，进一步加强禽流感防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

根据年度动物疫病监测计划，每月1次，在广州市白云区某家禽批发市场随机抽取鸡、鸭、鹅、鸽售卖档口若干，随机抽取档口内禽只及环境样品。每只家禽采集咽喉、泄殖腔棉拭子各1份，同一档口每5只家禽的棉拭子放入1个内含5 mL PBS液的10 mL离心管中；同时采集该档口的环境棉拭子样品（地面、围栏、污水、笼具、推车等），同一档口每3份环境棉拭子样品放入1个离心管中，低温保存送实验室检测。

每次采集的档口数量和样品数量依据监测计划和工作需求略有不同。

1.2 仪器与试剂

全自动核酸提取仪：美国Thermo公司；7500实时定量PCR仪：美国应用生物系统公司；LC480荧光定量PCR仪：瑞士罗氏公司。两台PCR仪根据检测工作安排随机使用。

禽流感病毒通用型核酸实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒：美国应用生物系统公司、中山大学达安基因股份有限公司、深圳太太基因工程有限公司产品；H7亚型禽流感病毒核酸检测试剂：中山大学达安基因股份有限公司、北京世纪元亨动物防疫技术有限公司、广州维伯鑫生物科技有限公司生产。

1.3 检测方法

标本冻融后置于振荡器充分混匀，按照美国应用生物有限公司AM1836-5 病毒核酸抽取试剂盒说明书和美国Thermo Scientific KingFisher Flex全自动磁珠提取纯化系统的操作方法，提取病毒RNA；按照禽流感通用型实时荧光定量 RT-PCR检测试剂盒使用说明书，在实时荧光定量 PCR 仪上进行检测。对通用型核酸阳性样品，进一步作H7亚型流感病毒核酸检测。

1.4 阳性群体/个体定义

将1个活禽批发档口作为1个统计禽群。该档口采集的家禽咽喉/泄殖腔棉拭子或环境棉拭子中，至少有1份呈禽流感病毒核酸阳性，定义为群体阳性。

每份禽流感病毒核酸阳性棉拭子样品，定义为个体阳性。

1.5 结果分析

通过Excel软件对数据进行整理分析，通过SPSS 20.0进行统计检验。

2 结果

2.1 禽流感病毒通用型核酸监测情况

2.1.1 不同年份 2013—2018年，共在该批发市场的254个（次）活禽售卖档口采集样品，检出通用型禽流感阳性125个，群阳性率为49.21%（125/254），共采集家禽咽喉/泄殖腔棉拭子和环境棉拭子样品3 611份，检出通用型阳性1 248份，个体阳性率为34.56%（1 248/3 611）。各年度阳性率处于波动状下降态势，2014年大幅度下降，之后逐步升高，2017年又大幅下降（表1）。

表1 2013—2018年某家禽批发市场禽流感病毒通用型核酸阳性结果统计

2.1.2 不同季节 将2013—2018年的个体阳性率按季度统计，发现一季度的阳性率总体高于其他季度，而其他季度中，有4个季度未监测到阳性（图1）。

图1 2013—2018年各季度禽流感病毒通用型核酸个体阳性率比较

2.1.3 不同样品 将2013—2018年的3 045份活禽棉拭子样品（鸡、鸭、鹅、鸽）与551份环境棉拭子样品进行比较，发现环境棉拭子样品阳性率（26.86%）低于禽棉拭子（35.63%），差异有统计学意义（P＜0.01）。2015、2018年的环境样品阳性率明显低于活禽样品（P＜0.01），其余年份二者的阳性率差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表2 不同样品禽流感病毒通用型核酸阳性检测结果比较

2.1.4 不同家禽品种 2013—2018年，在该市场共采集鸡棉拭子1 645份、鸭棉拭子570份、鹅棉拭子540份、鸽棉拭子290份，个体阳性率从高到低依次为鹅、鸭、鸡、鸽（图2）。以鸡棉拭子阳性率为参考，用风险比计算公式：风险比（RR）=不同家禽棉拭子阳性率/鸡棉拭子阳性率，分别计算风险比，发现鸽携带禽流感病毒的风险是鸡的0.75倍（P=0.01），鹅携带禽流感病毒的风险是鸡的2.04倍（P＜0.01），鸭携带禽流感病毒的风险是鸡的1.61倍（P＜0.01）。

2.1.5 不同品种家禽售卖档口 对2013—2018年不同品种家禽售卖档口的环境棉拭子阳性率进行比较，发现鸭售卖档口的环境阳性率最高（47.47%），其次是鹅售卖档口（27.84%），鸡售卖档口最低（16.73%），与对应家禽的个体阳性率分布不太一致（图3）。

图2 不同家禽品种个体阳性率比较

图3 不同品种家禽售卖档口环境禽流感病毒通用型核酸阳性率比较

2.2 H7亚型流感病毒核酸监测情况

对通用型禽流感核酸阳性样品进一步作H7亚型流感病毒核酸检测。结果显示，该市场2015年开始检测到阳性，2016—2017年阳性率达到高峰，而2018年未检出阳性。阳性样品均为鸡棉拭子和环境棉拭子（图4）。

图4 2013—2018年H7亚型流感病毒核酸监测情况

3 讨论

本研究对广州市交易量最大的某家禽批发市场2013—2018年的禽流感病原监测数据进行分析，发现该市场近年来的禽流感病毒通用型核酸阳性率呈波动状下降趋势。据林鸿等[5]研究，广州市家禽批发市场交易的活禽90%以上来自广东、广西两地，而该两地分别于2013年（H5N1亚型Re-6株）、2016年（Re-6株+ Re-8株）、2017年（H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株）更换家禽禽流感强制免疫疫苗毒株。不难发现，更换强制免疫疫苗毒株后的下一年（即2014、2017、2018年），批发市场的禽流感病毒载量均出现明显下降，说明及时更换与流行毒株相匹配的禽流感免疫疫苗，可有效防控交易市场的禽流感。

从季节分布来看，一季度的禽流感病毒核酸阳性率明显高于其他季度，这可能与广东省一季度既潮湿又寒冷，有利于病毒存活有关。但是二、三季度的阳性率也处于20%～30%之间的较高水平，说明季节差异缩小。因此，除了冬春季节要加强防控外，夏秋季也不可掉以轻心。从品种分布来看，各年度家禽样品阳性率与环境样品阳性率差异不大，但各品种家禽之间差异较大，水禽仍然是主要带毒品种，这与张海冰等[6]的研究结论一致。不同品种家禽售卖档口的环境棉拭子与对应家禽的棉拭子阳性率并不完全一致，但鸭、鹅阳性率及其售卖档口的环境阳性率都较高，说明应当重点加强鸭、鹅的市场防疫监管，督促落实清洗消毒。

2017年7月开始，我国在家禽养殖环节推广使用禽流感（H5+H7）二价苗，2018年该市场中没有检出H7亚型流感，广州市也无人H7N9流感感染病例，说明家禽免疫对于迅速减少市场中H7亚型流感病毒载量，阻断“禽—市场—人”的传播起到了良好作用。

本研究在时间分布上仅从年度和季度进行了简单的数据分析比较，也未对各年份该批发市场禽流感防控政策调整、休市频率及持续时间等对监测结果的影响做进一步分析。下一步有必要将监测数据细化，分析导致监测结果变化的可能因素，为切实了解本地区活禽批发市场的禽流感流行趋势和采取有针对性的防控措施提供依据。