新疆维吾尔族代谢综合征患者CETP基因单体型和连锁不平衡分析

李毓，王海霞，胡云华，张向辉，郭恒，何佳，闫贻忠，马儒林，郭淑霞

(石河子大学医学院预防医学系，新疆 石河子 832000)

代谢综合征(Metabolic Syndrome，MS)是一种慢性复杂性疾病，可引起多种并发症且危害严重，随着其发病率的升高，已成为全球性的重大公共卫生问题[1]。其临床特征主要有：中心性肥胖，血压、空腹血糖及甘油三酯(Triglycerides，TG)水平升高，高密度脂蛋白胆固醇(High-density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C)水平降低[2]。目前，基于MS具有进展性，在其定义上达成一致具有一定的困难[3]，而且，其组分也会随着时间的推移而恶化。此外，世界各国MS患病率普遍较高。2003至2010年，美国MS整体患病率为33%[4]。在澳大利亚，MS的患病率为30.7%[5]。日本，男性MS的患病率为22.8%，女性为8.7%[6]。在我国一项Meta分析显示，MS患病率为24.5%[7]。我们的前期调查结果显示，新疆维吾尔族人群MS患病率为21.2%[8]，低于顾东风等[9]报道的中国北方地区的MS患病率(23.3%)。在新疆的另一流行病学调查[10]显示，维吾尔族人群MS患病率为27.9%，略低于同一地区的汉族(31.3%)。然而，MS的病因目前尚不明确，可能主要由年龄、种族、遗传因素、饮食、行为和环境等因素引起[11]，并且，遗传因素已越来越引起人们的重视。

胆固醇酯转运蛋白(Cholesterol Ester Transfer Protein，CETP)介导血浆脂蛋白的交换和转运，被认为是胆固醇逆向转运的关键蛋白，受到CETP基因的调控。目前，关于CETP基因的研究主要集中于与血脂异常的关系，国内外学者对CETP基因多态性与MS各组分如高血压、糖尿病、低HDL-C血症等之间的相关性也已进行了深入研究[12-14]。在我们前期研究的CETP基因八个多态性位点中，rs1800775、rs3764261、rs12149545、rs711752、rs708272这五个多态性位点与维吾尔族和哈萨克族人群血脂异常有关[15]，相关研究报道CETP基因中六个多态性位点rs5882[16]、rs1800775[17]、rs3764261[18]、rs12149545[19]、rs711752[20]、rs708272[21]在不同人群中与MS及其组分具有不同程度的关联性。目前，关于CETP基因多态性与MS之间的相关性研究存在民族和地区差异[22-23]，且多是单个位点多态性的研究，尚未有关于新疆维吾尔族人群CETP基因多态性与MS之间关系的报道。因此，本研究探讨CETP基因六个多态性位点与维吾尔族人群MS及各组分的相关性，为新疆维吾尔族MS的遗传易感性研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

遵从成组匹配原则，经性别匹配后，在前期现况调查基础上[24]，随机选择280例MS患者作为病例组，291例健康者作为正常对照组。

1.2 流行病学调查与血生化检测

每位受试者均签署知情同意书。本研究由石河子大学医学院第一附属医院伦理审查委员会批准(IERB No. SHZ2010LL01)。所有调查员经严格培训并考核合格，对当地维吾尔族居民进行面对面询问，详细记录受试者的基本信息(个人史、疾病史、家族史、饮食、饮酒、吸烟和体育锻炼)。身高、体重、腰围、臀围、血压由专业人员根据标准化方法进行测量[25]。生化指标(总胆固醇(Total Cholesterol，TC)、TG、HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C)以及空腹血糖(Fasting Plasma Glucose，FPG))采用OLYMPUS2007全自动生化分析仪进行检测。

1.3 诊断标准

采用多机构联合声明(JIS)诊断标准[2]，在下列符合三项或三项以上者，即可诊断为MS：(1)中心性肥胖：男性腰围≥85 cm，女性腰围≥80 cm；(2)TG水平升高：TG≥150 mg/dL(1.7 mmol/L)；(3)HDL-C水平降低：男性<40 mg/dL(1.0 mmol/L)，女性<50 mg/dL(1.30 mmol/L)；(4)血压升高：收缩压≥130 mmHg或舒张压≥85 mmHg；(5)FPG升高：FPG≥100 mg/dL(5.6 mmol/L)。

1.4 DNA提取及CETP基因各位点测序

每个研究对象抽取空腹静脉血200 μL，采用北京TIANGEN生化科技有限公司DNA提取试剂盒进行DNA的抽提。所得DNA经0.7% 凝胶电泳验证后，采用Nano-Drop分光光度计测定其纯度和浓度。利用Mysequenom网站、AssayDesigner 3.0软件设计各位点引物(表 1)。

提取所得DNA样本送往上海捷瑞生物工程公司测序分析。

表1 CEPT基因位点上游及下游引物的序列Tab.1 The sequences of forward and reverse primers for genotyping of CETP gene

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 人口学评价及临床特征

两组间性别、吸烟以及饮酒比例差异均无统计学意义(P>0.05)。病例组平均年龄、体质指数(Body mass index，BMI)、腰围、臀围、收缩压(Systolic Blood Pressure，SBP)、舒张压(Diastolic Blood Pressure，DBP)、FPG、TG、TC、LDL-C水平均高于对照组(P均<0.001)，而HDL-C水平却低于对照组(P<0.001)(表2)。

表2 研究对象的人口学统计及临床特征Tab.2 Demographic and clinical characteristics of study subjects

2.2 基因型与等位基因频率分布比

rs5882位点基因型与等位基因频率在病例组和对照组中分布比较无统计学差异(P>0.05)。病例组rs3764261-T，rs708272-T、rs12149545-A以及rs711752-A的等位基因频率均低于对照组(均P<0.05)。而rs1800775-C的等位基因频率却高于对照组(P=0.011)。病例组和对照组六个位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)(表3)。

表3 对照组与病例组CETP基因6个SNP位点基因型及等位基因频率分布和HardyWeinberg平衡检验Tab.3 Genotype and allele frequencies for the six SNPs of CETP gene between control and case group and Hardy-Weinberg equilibrium testing

注：C-R: rs5882 (A-G)，rs1800775 (A-C)，rs3764261 (G-T)，rs12149545 (G-A)，rs711752 (G-A)，rs708272 (C-T)；HWE(Hardy-Weinberg Equilibrium)-P：哈迪-温伯格平衡定律P值；SNP(Single Nucleotide Polymorphisms):基因单核苷酸多态性。

2.3 MS危险因素分析

以MS为因变量(0=否，1=是)，分别以rs5882(AA=1，AG=2，GG=3)、rs1800775(AA=1，AC=2，CC=3)、rs3764261(GG=1，GT=2，TT=3)、rs12149545(GG=1，GA=2，AA=3)、rs711752(GG=1，GA=2，AA=3)、rs708272(CC=1，CT=2，TT=3)为自变量，控制年龄、性别(1=男性，2=女性)、吸烟(0=不吸烟，1=吸烟)和饮酒(0=不饮酒，1=饮酒)的影响后，分析各位点多态性与MS的关系(表4)。结果显示：在rs1800775位点，CC基因型(P=0.009，OR=1.922，95%CI=1.174-3.147)患MS风险高于AA基因型。在rs3764261位点，GT(P=0.001，OR=0.552，95%CI=0.387-0.788)和TT(P<0.001，OR=0.289，95%CI=0.145-0.573)基因型患MS风险低于GG基因型。在rs12149545位点，AG(P<0.001，OR=0.484，95%CI=0.339-0.693)和AA(P<0.001，OR=0.277，95%CI=0.137-0.560)基因型患MS风险低于GG基因型。在rs711752位点，AA基因型(P=0.005，OR=0.496，95%CI=0.305-0.805)患MS风险低于GG基因型。在rs708272位点，TT(P=0.004，OR=0.491，95%CI=0.302-0.797)基因型患MS风险低于CC基因型。

表4 CEPT基因6个SNP位点与代谢综合征的关系Tab.4 The relationship between six SNPs of CETP gene and MS

注：对照:rs5882-AA，rs1800775-AA，rs3764261-GG，rs12149545-GG，rs711752-GG，rs708272-CC；β-回归系数，S.E-标准误。

2.4 MS各组分的危险因素分析

我们进一步研究了六个位点多态性与MS各组分之间的关系(表5)。分别以中心性肥胖(0=否，1=是)、血压升高(0=否，1=是)、空腹血糖升高(0=否，1=是)、高TG血症(0=否，1=是)、低HDL-C血症(0=否，1=是)为因变量，进行单因素logistic回归。

结果显示：rs5882位点多态性与各组分间均没有关联。在rs1800775位点中，与AA基因型相比，AC(P=0.021，OR=1.480，95%CI=1.062-2.064)和CC(P<0.001，OR=2.231，95%CI=1.450-3.434)基因型低HDL-C血症患病风险更高，然而AC基因型(P=0.027，OR=0.543，95%CI=0.316-0.932)却能降低血糖水平升高的风险。在rs3764261位点中，与GG基因型相比，GT基因型会降低中心性肥胖(P=0.004，OR=0.631，95%CI=0.460-0.865)、高TG血症(P=0.002，OR=0.596，95%CI=0.432-0.823)以及低HDL-C血症(P=0.001，OR=0.575，95%CI=0.421-0.786)的患病风险，却会增加血糖水平升高的风险(P=0.001，OR=2.509，95%CI=1.449-4.345)。在rs12149545位点中，AG和AA基因型与各组分之间的关系与rs3764261位点中GT和TT基因型相似。在rs711752位点中，与GG基因型相比，AA(P<0.001，OR=0.470，95%CI=0.310-0.713)基因型低HDL-C血症的患病风险更低。在rs708272位点中， CT(P=0.043，OR=0.696，95%CI=0.490-0.988)和TT(P=0.026，OR=0.616，95%CI=0.402-0.943)基因型患高TG血症的风险低于CC基因型，同时，CT(P=0.043，OR=0.700，95%CI=0.496-0.989)和TT基因型(P<0.001，OR=0.466，95%CI=0.307-0.707)低HDL-C血症的患病风险也低于CC基因型。

表5 代谢综合征中CEPT基因6个SNP位点和5个成分的危险因素分析Tab.5 Risk factor analysis between six SNPs of CETP gene and five components in MS

注：对年龄和性别，吸烟和饮酒调整后进行分析。

2.5 连锁不平衡(LD)检验

经连锁不平衡分析，rs3764261与rs12149545(D’=1.000，r2=0.931)，rs711752与rs708272(D’=1.000，r2=0.996)之间存在完全连锁不平衡。另外我们还发现，rs1800775和rs711752(D’=0.833，r2=0.442)，rs1800775和rs708272(D’=0.833，r2=0.440)，rs3764261和rs711752(D’=0.880，r2=0.387)，rs3764261和rs708272(D’=0.874，r2=0.383)，rs12149545和rs711752(D’=0.979，r2=0.446)，rs12149545和rs708272(D’=0.972，r2=0.441)之间存在强的连锁不平衡(表6)。

表6 CEPT基因6个SNP位点连锁不平衡分析Tab.6 Linkage disequilibrium test for the six SNPs of CETP gene

注：右上三角为D’连锁不平衡系数；左下三角为r2相关系数。

2.6 单体型分析

通过SHEsis软件六个单核苷酸多态性成功形成了18种单体型，表7中为频率大于0.001的8个单体型。

结果(表7)显示对照组A-A-T-A-A-T和G-A-T-A-A-T单体型频率高于病例组(P均<0.05)。其他5个单体型的频率分布在两组间的差异则不具有统计学意义(P>0.05)。

表7 CEPT基因6个SNP位点的单体型频率在维吾尔族对照组和病例组间的差异Tab.7 The discrepancy of haplotype frequencies of six SNPs in CETP gene between the control and case group in the Uyghur

注：整体Χ2=27.353，P<0.001(对照组与病例组中单体型频率低于0.03未列入表格参加计算)；用A-C-G-G-G-C作为参考单体型以计算比值比；单体型基因顺序(从左到右)：rs5882 (A/G), rs1800775 (A/C), rs3764261 (G/T), rs12149545 (G/A), rs711752 (G/A), rs708272 (C/T)。

3 讨论

在我国，MS患病率普遍较高，且存在民族与地区差异，其中维吾尔族MS患病率低于同一地区的汉族和哈萨克族[10, 26]，这可能与维吾尔族独特的民族特色和遗传易感性有关。因此，我们选择维吾尔族这一人群来研究CETP基因多态性与MS之间的关系。鉴于CETP是胆固醇逆转运过程(RCT)中的一个关键交换因子，也是目前唯一已知的具有此功能的蛋白质，在脂蛋白的代谢中起非常重要的作用，已引起学者的研究重视[27]。研究发现，CETP基因突变可能会影响血清中CETP的含量，进而影响脂质代谢。

本研究发现，病例组平均年龄、BMI、腰围、臀围、血压、血糖、TG、TC、LDL-C水平均高于对照组，HDL-C水平低于对照组。中心性肥胖、TG升高、HDL-C水平降低、血压升高、FPG升高等症状导致了MS的发生，而HDL-C水平降低通常伴随着TC和LDL-C水平的升高。两组间的性别分布匹配，各位点均符合Hardy-Weinberg平衡，提示本研究样本具有一定代表性。

研究发现，rs5882基因型与等位基因频率分布在两组间均没有统计学差异。可能是由于样本含量太小引起，因此我们会通过后期扩大样本进行更加深入的研究。其他五个位点的基因型与等位基因频率分布在两组间差异均有统计学意义。在rs1800775位点中，与A等位基因携带者相比，C等位基因携带者MS的患病风险增加了35.6%，与Radovica I等[28]研究结果一致。在rs3764261位点，我们发现T等位基因在两组间的分布差异具有统计学意义，与Zhou L等[29]研究结果一致。目前，对于rs12149545和rs711752位点与MS的关联性研究较少，本研究发现，在rs12149545和rs711752两个位点中，与G等位基因相比，A等位基因可分别降低MS 47%和30.1%的患病风险。对于rs708272位点，与C等位基因相比，T等位基因可能会降低MS 30.4%的患病风险，与Anton S等[30]研究结果相近。不同的是，Jeenduang N[31]和Maroufi N F[32]认为T等位基因与MS不相关。基于以上发现，为了验证这一相关性的真实性，我们在控制了年龄，性别，吸烟和饮酒等相关因素后进行了非条件logistic回归分析。结果发现，这一相关性依然存在。rs3764261-GT/TT、rs12149545-AG/AA、rs711752-AA和rs708272-TT基因型可不同程度地降低MS的风险，可能与维吾尔族人群MS相关。rs708272是CETP基因中变异频率较高的位点之一，其研究也最为广泛。我们研究发现，在rs708272位点，与CC基因型相比，TT基因型可降低MS 50.9%的患病风险，可能是MS的一个保护因素。在埃及的一项研究表明[33]，B1B1(CC)基因型携带者具有更高的MS患病率，研究结果与我们一致。这同时也解释了维吾尔族MS患病率低于同一地区其他民族的原因。在rs1800775位点中，与AA基因型相比，CC基因型携带者患MS的风险增加了92.2%，可能是一个危险因素。目前，对于rs1800775位点多态性与MS的相关研究较少，但有研究表明，该位点多态性可能会增加低HDL-C血症的发病风险[17]。上述研究表明，CETP基因各位点多态性与MS的相关性具有种族与民族差异。

在分析了六个核苷酸与MS的关联后，我们进一步研究了该六个位点与MS各组分的关系。对于中心性肥胖，我们发现rs3764261-GT基因型和rs12149545-AG基因型，可以降低其患病风险。不同的是，Ruan X Y等[16]研究发现，Taq1B(rs708272)和I405 V(rs5882)多态性位点的次要等位基因与肥胖有关。对于空腹血糖升高，rs1800775-AC基因型能降低其患病风险而rs3764261-GT基因型和rs12149545-AG基因型却可能会增加其患病风险。然而，在心血管病人中的一项研究表明，rs3764261位点多态性与2型糖尿病不相关[34]。对于高TG血症，rs3764261-GT/TT、rs12149545-AG/AA和rs708272-CT/TT位点多态性可能会降低TG水平升高的风险，但是，在另一项研究中，并没有发现rs3764261位点多态性和TG水平升高有关[35]。我们还发现，rs5882位点之外的五个多态性位点均与低HDL-C血症有关。这一相关性也在其他研究中得到证实[15-16,21,28,33,36-37]。不同的是，Sekar Kathiresan等[38]认为rs1800775位点C等位基因携带者HDL-C水平较低。Edna J L Barbosa等[39]认为与CC基因型相比，TT和CT基因型携带者HDL水平更高。尽管如此，我们仍然认为低水平的HDL-C 是MS组分中与CETP基因多态性关联最紧密的组分。

我们采用SHEsis软件对CETP基因的八个单体型和MS的相关性进行了分析。结果发现，对照组A-A-T-A-A-T和G-A-T-A-A-T单体型频率高于病例组。因此，我们推测这两个单体型可能是维吾尔族人群MS的保护因素，可以降低MS的患病风险，保护人们免受MS的危害。然而，单体型的形成受许多因素的影响，我们仅仅只是在一个小的随机样本中研究了CETP基因多态性与MS的相关性。因此，这一复杂关系需要我们进一步地探索和验证。

4 局限性

尽管我们进行了全面的分析，但研究中仍然存在潜在的局限性。首先，研究的样本量较小，研究结果可能存在一定的偶然性。其次，CETP基因中存在180多个多态性位点。我们仅选择了六个功能性位点来研究CETP基因和MS之间的关系。因此，研究结果可能存在一定的片面性。此外，我们分析了六个多态性位点与MS及其组分的相关性，但没有研究基因和基因以及基因和环境之间的交互作用，所以需要进一步研究其交互作用。

5 结论

CETP基因rs1800775，rs3764261，rs12149545，rs711752和rs708272位点多态性与新疆维吾尔族人群MS及其各个组分均密切相关，其中低水平的HDL-C与CETP基因多态性的关联最为紧密rs3764261与rs12149545以及rs711752与rs708272之间存在完全连锁不平衡关系。A-A-T-A-A-T和G-A-T-A-A-T单体型可能是维吾尔族人群MS的保护因素。