中药复方健宫散对子宫炎奶牛免疫功能的影响

2019-07-11张保军乔彦杰梁小瑞王丹阳刘贤侠谷新利

石河子大学学报（自然科学版） 2019年3期

张保军，乔彦杰，梁小瑞，王丹阳，刘贤侠，谷新利

(石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003)

随着奶牛养殖业的快速发展，繁殖障碍问题越来越突显，不孕症已成为世界三大流行病之一[1]。子宫炎是引起不孕症的主要原因之一[2]，该病常引起子宫复旧不全，卵泡发育异常，使奶牛繁殖力和产奶量下降，给奶牛养殖户造成了巨大的经济损失。奶牛产后由于受到产犊和泌乳等应激因素的影响，容易导致免疫机能下降，子宫受到感染引发子宫炎[3]。子宫受到细菌感染后，机体通过非特异性免疫系统和特异性免疫系统进行免疫防御。免疫球蛋白(Ig)是黏膜免疫和体液免疫中发挥重要防御功能的蛋白质，在抗子宫感染过程中发挥着重要作用[4]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)是T淋巴细胞分泌并参与细胞免疫的细胞因子。Gilmansachs[5]发现高浓度的TNF-α和IFN-γ能加速炎症的发展，影响胚胎的着床，对妊娠产生负面影响。有学者推测，细胞免疫功能障碍与亚临床子宫内膜炎并存可能是导致晚期子宫炎症的主要原因[6]。

目前，治疗奶牛子宫炎多选用抗生素疗法，重复大量的使用抗生素容易引发细菌耐药性，引起机体抵抗力下降或菌群紊乱，导致其他疾病[7]。中草药具有安全无毒且不易引发细菌耐药性等优点，在治疗疾病上越来越受到人们的青睐。近年来，许多中草药及其提取物已显示出积极的治疗作用，包括抑菌、抗炎和抗癌等[8]。本研究通过检测中药健宫散治疗奶牛子宫炎前后血清中Ig G、Ig M和IFN-γ、TNF-α 4种免疫学指标含量的变化情况，探讨中药健宫散对子宫炎奶牛免疫功能的影响，为今后健宫散的深度开发利用提供科学依据，提升中草药服务于现代奶牛产业的能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

B超仪(型号HS-101 V)，配备直肠线阵变频探头，扫查深度6～24 cm；Power Wave XS2 Bio Tek©酶标仪(型号ELx800)；离心机(型号H1850R)，购自长沙湘仪离心机仪器有限公司；微量快速震荡仪(型号QB-9002 Kylin-Bell)，购自Lab Instruments公司；微孔板脱水仪(型号BIOS-401)，购自BIOSCIENCE梅奥赛斯(天津)生物科技有限公司。

1.1.2 药品与试剂

健宫散(散剂，400 g/袋)，由石河子大学动物科技学院中兽医学研究室研制而成，由益母草、当归、川芎、五灵脂、桃仁、甘草等中药组成，方中各药材均购自当地药店。

牛血清Ig G(批号：E11I0058)、Ig M(批号：E11I0038)、IFN-γ(批号：E11I0345)和TNF-α(批号：E11T0008)ELISA检测试剂盒均购自上海Blue Gene生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 临床症状、阴道分泌物性状判断子宫炎的标准

临床上出现体温高于39.5 ℃，呼吸速率加快，精神萎靡，食欲不振，反刍减少等症状；努责、拱腰、举尾时从阴道流出大量污浊或棕黄色黏液脓性分泌物，有腥臭味，内含絮状物或胎衣碎片，常附着尾根，形成干痂的则为子宫奶牛；否则为正常健康奶牛。

1.2.2 B超检查判断子宫炎的标准

B超检查时若子宫角变粗，子宫壁增厚；子宫内蓄积白色或灰黄色渗出物，触之有明显的波动感，则判定为子宫炎奶牛，否则为正常健康奶牛。

1.2.3 试验动物与分组

在新疆石河子西部牧业优良种畜繁育中心奶牛场选择年龄、胎次、产奶量相近，饲养条件一致，无传染病及寄生虫病的中国荷斯坦奶牛18头。根据临床症状、阴道分泌物性状及B超检查结果，共诊断出健康奶牛6头作为正常组；子宫炎奶牛12头，其中6头进行中药治疗作为治疗组；另外6头不进行治疗，作为患病组，记录所有供试奶牛的产犊日期。

1.2.4 投药及采血

治疗组奶牛每头每天灌服健宫散400 g，每天1次，连续灌服1个疗程(7 d)，正常组和患病组不进行任何处理。治疗组奶牛灌服健宫散前采血1次，用药中期(即第3天用药)采血1次，灌药结束后第1、4、7、11、15、20天每天采血1次，共采血8次，采血时间为14:00—16:00，正常组、患病组在同时间采血，采血次数同治疗组。

1.2.5 样品的采集

清晨空腹尾静脉采取血液5 mL，室温静置自然析出血清，装于1.5 mL离心管中，置于-80 ℃冰箱中，待检。

1.2.6 指标的测定

Ig G、Ig M、TNF-α和IFN-γ含量测定均采用ELISA法，按照说明书在酶标仪上操作进行，分别在450 nm条件下读取OD值并制作标准曲线，根据曲线方程求得血清含量值。

1.2.7 疗效判定

用药1～3个疗程后，在45 d内出现发情症状、并排卵者记为有效，怀孕受胎者记为治愈，用药后不发情也不排卵受孕者记为无效。

1.2.8 统计分析

应用Excel软件进行数据统计，SPSS l7.0软件对数据单因素方差分析，试验数据均以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 健宫散对奶牛子宫炎的治疗效果

健宫散对奶牛子宫炎的治疗效果结果见表1。

表1 健宫散治疗奶牛子宫炎的疗效情况Tab.1 Curative effect of Jiangong powder on dairy cows with uteritis

2.2 中药健宫散治疗奶牛子宫炎对血清Ig G含量的影响

由表2可知，用药前，治疗组血清Ig G含量与患病组相比差异不显著(P>0.05)，极显著低于正常组(P<0.01)；用药中，治疗组血清Ig G含量显著高于患病组(P<0.05)，相比正常组差异极显著(P<0.01)；用药后第1天，治疗组极显著低于正常组(P<0.01)，用药后的第1天之后其含量逐渐升高，随着用药时间的延长，免疫调节的变化，基本达到正常水平，且差异不显著(P>0.05)，相比患病组差异极显著(P<0.01)；患病组用药前后整体变化幅度不大，各时间点与正常组比较差异极显著(P<0.01)。

表2 血清Ig G含量测定结果

注：同列数据肩标大小写字母均不相同表示各组组间比较差异极显著(P<0.01)；大写字母相同小写字母不同表示差异显著(P<0.05)；字母完全相同表示差异不显著(P>0.05)。

2.3 中药健宫散治疗奶牛子宫炎对血清Ig M含量的影响

由表3可知，用药前和用药中，治疗组和患病组血清Ig M含量均显著低于正常组(P<0.01)，治疗组与患病组Ig M含量差异不显著(P>0.05)；经健宫散治疗后，治疗组Ig M含量呈现缓慢升高的趋势，在用药后的第4天之后，其含量极显著高于患病组(P<0.01)，结束用药后治疗组Ig M含量恢复到正常水平，其变化规律与正常组相似；患病组血清Ig M含量在用药后第1天和第4天相比正常组差异不显著(P>0.05)，用药后的第4天之后与正常组差异极显著(P<0.01)，整体呈现先快速下降后缓慢升高的变化趋势。

表3 血清Ig M含量测定结果

2.4 中药健宫散治疗奶牛子宫炎对血清IFN-γ含量的影响

由表4可知，用药前、用药中和用药后第1天，治疗组和患病组血清IFN-γ含量均极显著高于正常组(P<0.01)，治疗组与患病组差异不显著(P>0.05)；用药后第4天，治疗组IFN-γ含量显著低于患病组(P<0.05)，患病组显著高于正常组(P<0.05)；第4天之后，患病组IFN-γ含量先升高再降低呈波动变化，相比治疗组差异极显著(P<0.01)，与正常组比较差异极显著(P<0.01)；治疗组IFN-γ含量在用药后逐渐下降，用药后的第1天之后，其水平略高于正常组，但相比正常组差异不显著(P>0.05)，用药后第20天恢复正常水平。

表4 血清IFN-γ含量测定结果

2.5 中药健宫散治疗奶牛子宫炎对血清TNF-α含量的影响

由表5可知，用药前、用药中和用药后第1天，治疗组和患病组血清TNF-α含量均显著高于正常组(P>0.05)，治疗组与患病组差异不显著(P>0.05)；健宫散治疗后，含量开始降低，用药后第4天，治疗组TNF-α含量显著低于患病组(P>0.05)，与正常组比较差异极显著(P<0.01)；用药后的第4天之后，治疗组极显著高于患病组(P<0.01)，并逐步达到正常水平，其变化规律与正常组相符且差异不显著(P>0.05)；患病组TNF-α含量在用药后的第1天之后先升高后降低呈波动变化且前后变化幅度差异较大，相比正常组差异极显著(P<0.01)。

表5 血清TNF-α含量测定结果

3 讨论

3.1 健宫散治疗前后血清中Ig G和Ig M含量的变化

Ig广泛分布于动物外周血液、淋巴液和组织分泌液中，包括Ig M、Ig A、Ig E、Ig G等多个类型，主要由B淋巴细胞产生，参与子宫局部免疫和体液免疫。研究发现，子宫分泌物和血液中同时存在Ig的所有类型，子宫分泌物中以Ig G和Ig A为主，Ig M较少，血液中则以Ig G、Ig M为主[9]。有报道称[10-11]，Ig浓度的变化可反映子宫的免疫状态。刘文[12]发现，产后7天患子宫内膜炎奶牛血清中Ig G含量极显著高于健康奶牛。Herr等[13]研究了围产期奶牛免疫状态的变化，发现血清中Ig G和Ig M水平分别在产后第4周和第8周显著下降，在产犊时达到最低值。产后第4周时，Ig G恢复到正常水平，而Ig M浓度仍较低，Ig G的减少与初乳中Ig G的浓度有关。那立冬等[14]对产后21天～42天子宫内膜炎奶牛血清中免疫球蛋白质量浓度的变化趋势进行研究，发现子宫内膜炎奶牛血清中Ig G先降低后升高，而Ig M持续降低，Ig G和Ig M分别在体液免疫和子宫局部免疫中发挥作用。李德军[15]研究了产后7天～49天奶牛临床型子宫内膜炎和隐性子宫内膜炎的发病机制，发现临床型子宫内膜炎组和隐性子宫内膜炎组奶牛血清中Ig G浓度均呈升高趋势，且极显著低于健康对照组(P<0.01)；临床型子宫内膜炎组奶牛血清中Ig M浓度极显著低于健康对照组(P<0.01)，隐性子宫内膜炎组奶牛血清中Ig M浓度产后7天后有所下降，之后开始升高，在产后42天时高于健康对照组，与对照组差异不显著(P>0.05)。本研究发现，用药前治疗组和患病组Ig G和Ig M含量显著低于正常组，在用药后的第1天之后治疗组Ig G和Ig M恢复正常水平，总体变化规律与正常组相似。患病组Ig M含量在用药后的第4天之后极显著低于正常组，而Ig G含量用药前后始终极显著低于正常组，患病组奶牛血清中Ig G在停药后第4天出现低谷值，之后有回升的趋势，这与李得军[15]报道的结果相似。患病组奶牛血清中Ig M先降低，用药后第7天出现低谷值，之后开始回升，前后变化幅度相同。这与李得军[15]和那立冬[14]等研究的结果一致。

张春刚等[16]研究发现，由益母草、黄芪等组成的中草药添加剂可提高奶牛血清Ig M和Ig G的含量。贾斌等[17]也研究发现，中草药添加剂(由益母草、当归、陈皮等组成)能显著提高奶牛血清Ig G和Ig M含量。李清艳等[18]利用中药宫炎散(由当归、甘草等组成)治疗奶牛子宫内膜炎，发现宫炎散可显著提高子宫内膜炎奶牛血清中Ig G的含量。郭亚男等[19]研究发现由益母草、当归、黄芪等药材自制而成的复方中草药片剂能显著提高产后奶牛血清Ig G和Ig M的含量。本试验可见，治疗组奶牛血清中Ig G和Ig M含量分别在用药后第1天和用药后的第4天之后极显著高于患病组，说明健宫散能调节Ig G和Ig M的分泌，提高Ig G和Ig M的含量，原因可能是健宫散中益母草、当归、甘草调节Ig G和Ig M的分泌，使得Ig G和Ig M的含量升高。

3.2 健宫散治疗前后血清中IFN-γ含量的变化

IFN-γ是一种促炎性细胞因子，主要由活化的Th1细胞产生，可抑制Th2型细胞因子的产生[20]。参与细胞免疫调节，促进TNF-α的分泌，抑制体液免疫功能，刺激NK细胞增强其细胞毒性功能，在机体免疫炎症反应中发挥了重要作用。韩莉莉等[21]研究发现宫颈炎患者血清中IFN-γ的水平均随着病变严重程度的增加而减少。Zhang等[22]发现慢性子宫内膜炎不孕妇女IFN-γ mRNA的表达显著高于正常组。Mollo等[23]探讨了子宫内膜息肉患者血清和子宫内膜活检组织中IFN-γ的水平，发现IFN-γ在子宫内膜息肉患者血清和组织活检中均显著升高。本试验中，用药前治疗组和患病组血清IFN-γ含量显著高于正常组，治疗组IFN-γ含量在用药后的第1天之后与正常组差异不显著，而患病组IFN-γ含量用药前后始终极显著高于正常组，用药后患病组IFN-γ含量缓慢升高，用药后第7天出现峰值，随即下降，前后变化幅度相同。这可能是炎症前期体液免疫占主导地位，IFN-γ含量升高抑制体液免疫的进行，后期各促炎细胞因子间相互拮抗或协同作用，中性粒细胞和单核巨噬细胞吞噬作用增强，再加之子宫本身的固有免疫力，因此出现IFN-γ下降的趋势。

研究发现，益母草中的多糖成分能显著提高小鼠血清IFN-γ的含量水平[24]。袁颖等[25]也发现当归与黄芪配伍后可增加气道变应性炎症大鼠血清中IFN-γ的含量从而抑制炎症反应。甘草酸是甘草中重要的活性成分之一，通过与淋巴细胞受体结合，诱导机体产生IFN-γ发挥免疫调节作用[26]。吕小华[27]研究表明，甘草和甘草酸能显著提高小鼠血清IFN-γ的含量(P<0.05)。本试验中，治疗组IFN-γ含量在用药后的第4天之后极显著低于患病组。说明健宫散降低了IFN-γ的含量，原因可能是健宫散中益母草、当归多糖、甘草酸等共同调节了IFN-γ的表达，促使子宫炎奶牛血清中IFN-γ的含量降低。

3.3 健宫散治疗前后血清中TNF-α含量的变化

TNF-α是炎性细胞因子，可诱导细胞凋亡，引起发热等全身症状，通过刺激单核细胞和巨噬细胞生成与释放IL-1和IL-8，导致炎症进一步发展扩大[28]。有研究显示，适量的TNF-α是免疫防御的关键，而过量TNF-α能引起机体炎性损伤，加重炎症程度[29]。Galvão等[30]研究了产后早期发生子宫内膜炎奶牛TNF-α基因表达水平，发现子宫内膜炎奶牛子宫中TNF-α基因表达在分娩和产后第1周均低于健康对照奶牛，而第5周后表达显著提高。Brodzki等[31]发现患亚临床型子宫内膜炎奶牛血清TNF-α表达水平在产后22 d极显著高于健康组，产后40 d显著高于健康组；患子宫内膜炎奶牛TNF-α表达水平在产后40天低于健康奶牛。Kim等[32]研究发现临床型子宫内膜炎奶牛血清TNF-α水平显著高于亚临床型子宫内膜炎奶牛和正常健康奶牛。Ghasemi等[33]发现亚临床子宫内膜炎奶牛TNF-α mRNA表达水平提高了20倍。胡路锋[34]对产后1～35天子宫炎奶牛血清中TNF-α浓度进行检测，发现子宫炎组奶牛血清中TNF-α浓度逐渐升高，持续下降后缓慢升高恢复正常，整体上呈升高趋势，且子宫炎组奶牛TNF-α浓度始终低于正常组。付才等[35]发现，产后45天患子宫内膜炎奶牛血清中TNF-α含量高于正常健康奶牛。本试验可见，用药前治疗组和患病组血清TNF-α含量显著高于正常组，在用药后的第4天之后相比正常组差异不显著，总体变化规律与正常组相似；患病组TNF-α含量在用药后的第1天之后极显著高于正常组。其含量变化呈先升高后缓慢降低至用药前的状态，前后变化幅度不大。这与上述研究报道的结果一致。

益母草常用于治疗产科疾病，研究表明，益母草能显著降低产后子宫内膜炎大鼠血清TNF-α的含量[36]。杨兴斌等[37]研究表明，当归多糖通过与巨噬细胞结合促进TNF-α的分泌。凌婧等[38]报道，川芎油通过降低大鼠血浆中TNF-α的含量以减少由于损伤导致的炎症反应。申保生等[39]研究发现，复方甘草酸苷能显著降低肝炎患者血清TNF-α的含量(P<0.05)。在复方组成上，李清艳等[18]利用中药宫炎散(由当归、甘草等组成)治疗奶牛子宫内膜炎，发现宫炎散能降低子宫内膜炎奶牛血清TNF-α的含量。彭津津等[40]研究发现，复宫散(由益母草、当归、川芎、桃仁、红花、赤芍等多种药材组成)能显著降低子宫内膜炎模型家兔血液中TNF-α的含量(P<0.05)。贾书红等[41]研究发现，由益母草、当归、川芎、桃仁、五灵脂、甘草等组成的中药复方宫炎净中生物碱能显著降低子宫内膜炎家兔血清中TNF-α的含量(P<0.05)。本试验可见，治疗组TNF-α含量在用药后的第4天之后极显著低于患病组，且经健宫散治疗后的子宫炎奶牛已发情受胎(表1)，说明健宫散降低了TNF-α的含量，原因可能是健宫散中益母草、当归多糖、川芎等发挥了抗炎功效，抑制了免疫细胞TNF-α的分泌，改善了奶牛的炎症程度，使得子宫炎奶牛血清中TNF-α的含量降低。