外源H2O2对NaCl胁迫下番茄幼苗生长及生理指标的影响

冯玉龙，邢嘉怡，刘慧英，崔金霞，徐巍，张硕

(1石河子大学农学院园艺系/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆 石河子832000)

近年来，土壤次生盐渍化严重限制了保护地农业生产和可持续发展。盐胁迫对植物的生长发育造成许多不利影响，其引起渗透胁迫、离子毒害和营养失衡，使根系活力下降，生长受抑[1]。耕作土层次生盐渍化通过破坏清除活性氧(ROS)的抗氧化系统，使得内源活性氧(H2O2,O2·-)水平提高，破坏细胞膜蛋白质磷脂双分子层结构，造成细胞内代谢不能有序的进行，从而导致植物生理过程受阻，严重限制植株的生长[3]。因此，如何缓解盐胁迫和增强植物的抗盐性，已成为设施生产的重要问题。

过氧化氢 (Hydrogen peroxide,H2O2) 是植物体生长发育过程中产生的活性氧。近年来的研究发现，以 H2O2为中心的 ROS爆发是动植物对外界生物与非生物胁迫响应的普遍特征[4-6]。H2O2对植物具有双重作用，一方面H2O2可以作为信号分子通过介导细胞氧化还原状态来诱导植物生长和发育过程、参与对环境适应的信号转导，另一方面高浓度H2O2具有强氧化性，从而对植物产生氧化胁迫作用。H2O2对植物的具体表现因施用的浓度和部位以及植物细胞的具体生理条件不同而不同。研究[7-9]发现低浓度H2O2预处理能够打破种子休眠,促进种子萌发,提高抗氧化酶活性,降低膜脂过氧化程度,缓解叶绿体膜的伤害,从而增强黄瓜[7]、燕麦[8]和玉米[9]幼苗的耐盐性。此外,H2O2作为第二信使在细胞程序性死亡[10]、配体与受体的相互作用、保护酶系统的激活、基因的表达和诱导植物抗病性等过程中起到不可缺少的作用[11]。

近年来,已有许多H2O2参与生物和非生物胁迫防御应答的研究，但目前H2O2对于调控植物盐适应的作用依然十分有限。因此,本文以番茄“中蔬四号”的幼苗为材料，采用药理学手段，通过对NaCl胁迫下番茄幼苗叶片外源分别施用H2O2和二甲基硫脲(dimethylthiourea,DMTU。一种H2O2的淬灭剂)来调控内源H2O2水平，研究H2O2对盐胁迫下番茄幼苗生长及生理特性的影响，为进一步阐明番茄耐盐性形成机制提供理论依据。

1 试验材料与测量指标的方法

1.1 试验材料与试验设计

选用番茄(LycopersiconesculentumMill.)品种“中蔬四号”作为供试材料。试验材料于2017～2018年在石河子大学农业试验站日光温室内种植与进行处理。番茄种子温汤浸种、催芽露白后播种于含有草炭和蛭石(1∶1,V/V))基质的72孔穴盘中育苗，培养幼苗至两叶一心时，挑选生长势一致的健壮幼苗移入有苯板覆盖的12 L水桶中，装入10 L营养液(pH 6.2)。待7 d幼苗长至四叶一心时进行试验处理。

试验设置以下5个处理:(1)不喷施H2O2且不加NaCl，叶片喷施蒸馏水(CK)；(2)加入100 mmol/L NaCl和叶面喷施蒸馏水(NaCl)；(3)添加100 mmol/L NaCl和叶片喷施5 mmol/L DMTU (D)；(4)添加100 mmol/L NaCI和叶片喷施0.01 mmol/L H2O2(H)；(5)添加100 mmol/L NaCI和叶片喷施0.01 mmol/L H2O2+5 mmol/L DMTU(HD)。

NaCl、DMTU和H2O2的施用浓度均为课题组前期试验筛选所得。

试验期间，NaCl先用水溶解后加入种植桶中，模拟设施耕作层土壤盐渍化环境；外源H2O2和 DMTU装入锡箔纸遮光包裹的250 mL的药壶中于每日9:30喷洒于番茄幼苗叶片上下部。

试验采取随机区组设计，3桶/处理，4株/桶，于处理第6 d取样并测定各项指标。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 形态指标的测定

分别取第6 d各处理内长势一致的植株参考周艳[12]的方法测定株高、茎粗、干重、鲜重。

1.2.2 生理指标的测定

用TTC法[13]测定根系活力；电导法测定电解质渗透率；茚三酮比色法[14]测定脯氨酸含量；硫代巴比妥酸法[15]测定MDA含量；参照张宪政的方法[16]测定叶绿素含量；参照Rao and Sresty[17]的方法测定SOD活性，POD和CAT活性测定参照Zhang的方法[18]。

1.3 数据的整理与分析

使用SPSS 19.0对数据进行统计和多重比较的分析，最后将统计和分析的数据结果用WPS 2019和Origin 9.0做成所需的表格和图片，表、图中的数据用平均值±标准差(Mean ± SD)表示。

2 试验结果与数据分析

2.1 外源H2O2对NaCl胁迫下番茄幼苗形态指标的影响

结果见表1和图1。

由表1可知：与CK相比，NaCl处理显著抑制了番茄幼苗的株高、茎粗、地上及地下部鲜重和干重；与NaCl处理相比，D和H处理均显著提高了番茄幼苗的株高、地上及地下部鲜重和干重，且H处理的株高、地上及地下部鲜重和干重显著高于D处理。2个处理对幼苗的茎粗无显著影响；与H处理相比，HD处理下幼苗的株高、地上部鲜重和干重和地下部干重均显著降低，而茎粗和地下部鲜重无显著变化。

表1 外源H2O2对NaCl胁迫下番茄幼苗形态指标的影响Tab.1 Effect of exogenous H2O2on the morphological indexes of tomato seedlings under NaCl stress

注:小写字母表示处理间在0.05水平显著性差异。

图1显示：与CK相比，番茄幼苗的根系活力在NaCl处理下显著降低了47%；与NaCl处理相比，D、H、HD 3个处理下番茄幼苗的根系活力分别提高了5%、25%和10%，但均显著低于CK。H处理的根系活力显著高于D处理的，而HD处理的根系活力显著低于H处理的。

图1 外源H2O2对盐胁迫下番茄幼苗根系活力的影响Fig.1 Effect of exogenous H2O2 on the root activity of tomato seedlings under NaCl stress

2.2 外源H2O2对NaCl胁迫下番茄幼苗叶片叶绿素a和叶绿素b的影响

结果(表2)显示：NaCl处理较CK显著降低了番茄幼苗的光合色素Chla和Chlb的含量；与NaCl处理相比，D、H、HD 3个处理均显著提高了番茄幼苗Chla和Chlb的含量，其中H处理的Chla和Chlb的含量显著高于D和HD处理的，HD处理的Chla的含量和Chlb的含量分别显著高于和低于D处理的。

2.3 外源H2O2对NaCl胁迫下番茄幼苗电解质渗透率和细胞膜脂过氧化的影响

由结果(表3)可知：NaCl处理下番茄幼苗叶片的电解质渗透率和MDA含量分别较CK提高了4倍和1.4倍；与NaCl处理相比，D、H、HD 3个处理下的电解质渗透率和MDA含量均显著降低，但3个处理均显著高于CK。H处理的电解质渗透率和MDA含量均显著低于D处理，D处理显著低于HD处理的。

表2 外源H2O2对NaCI胁迫下番茄幼苗 叶片叶绿素a和叶绿素b的影响Tab.2 Effect of exogenous H2O2 on the Chla and Chlb content in leaves of tomato seedlings under NaCl stress

注:小写字母表示处理间在0.05水平显著性差异。

表3 外源H2O2对盐胁迫下番茄幼苗叶片电解质 渗透率和丙二醛(MDA)含量的影响Tab.3 Effect of exogenous H2O2 on the electrolytic leakage and MDA content in leaves of tomato seeding under NaCl stress

注:小写字母表示处理间在0.05水平显著性差异。

2.4 外源H2O2对NaCl胁迫下番茄叶片脯氨酸(Pro)含量的影响

由结果(图2)可知：与CK相比，NaCl处理使番茄叶片中Pro含量显著增加；与NaCl处理相比，D、H、HD 3个处理下番茄叶片的Pro含量均显著增加。H处理番茄叶片的Pro含量显著高于D与HD处理，D与HD处理间无显著差异。

图2 外源H2O2对盐胁迫下番茄幼苗叶片Pro含量的影响Fig.2 Effect of exogenous H2O2 on the contents of proline in leaves of tomato seedlings under NaCl stress

2.5 外源H2O2对NaCl胁迫下番茄幼苗叶片H2O2含量的影响

结果(图3)显示：与CK相比，NaCl胁迫处理显著提高了番茄幼苗叶片中H2O2含量;与NaCl处理相比，D、H、HD 3个处理下的H2O2含量均显著降低。H处理番茄叶片的H2O2含量显著高于D与HD处理，HD显著低于D处理的。

图3 外源H2O2对盐胁迫下番茄幼苗H2O2含量的影响Fig.3 Effect of exogenous H2O2 on the contents of H2O2 in leaves of tomato seedlings under NaCl stress

2.6 外源H2O2对NaCl胁迫下番茄幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

由结果(表4)可知：同CK相比，NaCl胁迫处理可使番茄幼苗叶片中SOD、POD和CAT 3种抗氧化酶的活性显著下降；H和D处理下番茄幼苗叶片中3种抗氧化酶的活性均显著提高，且H处理下SOD和POD抗氧化酶的活性均显著低于于D处理，CAT显著高于D处理；与H处理相比，HD处理下番茄叶片中SOD和POD活性显著降低，而CAT活性显著提高。

表4 外源H2O2对盐胁迫下番茄幼苗抗氧化酶活性的影响Tab.4 Effect of exogenous H2O2 on antioxidant enzyme activities of tomato seedling under salt stress

3 讨论

(1)H2O2是植物体内一种重要的ROS，高浓度H2O2对植物产生伤害，而H2O2在低浓度作为信号分子，参与植物对非生物胁迫的响应[19-22]。本文研究发现，NaCl胁迫下显著增加了内源H2O2水平，高水平内源H2O2显著抑制了番茄幼苗的生长和降低了番茄幼苗光合色素的含量。而盐胁迫下叶面喷施H2O2(H处理)和DMTU(D处理)均能不同程度显著降低内源H2O2水平，提高番茄幼苗的株高、地上、地下部干鲜重和根系活力和光合色素含量，说明外源喷施H2O2和DMTU均能通过降低内源H2O2水平而缓解NaCl胁迫对加工番茄幼苗生长的抑制作用和提高幼苗盐适应性。而喷施 H2O2缓解NaCl胁迫的效果优于喷施DMTU的，这与NaCl胁迫下喷施 H2O2的番茄幼苗叶片内源H2O2水平高于喷施DMTU的相一致(表1、表2、表3和图1)，表明植物体内维持一定较高水平的H2O2有利于提高番茄的盐适应性。

前人研究发现外源低浓度的H2O2显著减轻了小麦[23]和烟草[24]膜脂过氧化程度，增加了Pro含量，增强了植物抗盐性。本文研究亦表明叶面喷施H2O2和DMTU均能显著降低盐胁迫下番茄幼苗电解质渗透率和MDA含量和显著提高了脯氨酸含量(表3 和图2)，说明通过药理学手段降低内源H2O2水平能有效降低NaCl胁迫下番茄幼苗膜脂过氧化程度，并诱导渗透调节，从而缓解NaCl胁迫伤害，从而增强番茄幼苗的抗逆性。另外，3个分别外源喷施H2O2、DMTU和H2O2+DMTU处理下的内源H2O2水平与缓解盐胁迫的效果相一致，其中以NaCl胁迫下喷施 0.01 mmol/L H2O2的缓解效果最好。

(2)植物体有氧代谢过程中会产生少量ROS，微量的ROS作为信号分子在调节植物的生理过程和参与调控胁迫反应中扮有重要的角色[25]。盐胁迫会使植物体内积累大量ROS(H2O2，O2·-，OH-等)，从而导致ROS的产生与清除系统失去平衡[26]。正常生长情况下植物体内的抗氧化系统在清除ROS氧化损伤中扮有重要的角色。SOD能催化O2·-发生歧化反应产生H2O2和O2，H2O2随后主要被POD、CAT和AsA -GSH循环清除。

本文研究表明，NaCl胁迫显著提高了H2O2含量，降低了SOD、POD、CAT三种酶活性，低活性的酶导致ROS的大量积累，从而导致膜脂过氧化，最终使膜系统变性[27]。而叶面喷施H2O2和DMTU均显著提高了NaCl胁迫下SOD、POD、CAT三种酶的活性，其中外源H2O2诱导POD活性提高效果显著、而外源DMTU诱导SOD和CAT活性提高显著；叶面喷施H2O2+DMTU的处理显著提高了CAT活性，但降低了SOD和POD活性。说明NaCl胁迫破坏了番茄ROS清除系统，而外源喷施适宜浓度H2O2和DMTU能诱导不同的抗氧化酶活性清除ROS，从而有效增强番茄幼苗的抗(耐)盐性。

3 结论

将适宜浓度的H2O2(0.01 mmol/L)和DMTU(5 mmol/L)喷洒在NaCl胁迫番茄幼苗上，可以增强其渗透调节能力，提高其氧化酶活性，并使植物体内的H2O2水平下降，过氧化反应减弱，氧化胁迫减轻，脂膜过氧化程度下降，从而起到保护作用，缓解NaCl胁迫带来的抑制效果，提高幼苗适应能力，增强幼苗抗盐性，且以0.01 mmol/L H2O2施用的缓解NaCl的效果最为显著。