乳头状甲状腺癌中microRNA-599、BRD4表达及与临床病理特征和预后的关系

赖明华，杨岚淞

（云南省第一人民医院 1.乳腺甲状腺外科，2.消毒供应中心，云南 昆明 650032）

乳头状甲状腺癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是甲状腺癌最常见的分化类型，约占甲状腺癌发生的85%，具有肿瘤生长缓慢、恶化程度低、潜伏时间长等特点[1]。近年来，PTC 发病率呈上升趋势，虽然在其治疗方面取得了进展，但其存活率仍存在进一步改善的可能。明确高危病变临床有用预测因子是诊断和治疗惰性和侵袭性疾病的关键[2]。MicroRNA（miRNA）是具有调节功能和显著组织特异性的小RNA 分子，能够调节若干通路的多个靶标，常在癌症中异常表达，已成为一类癌症诊断、治疗及预后判断的新型生物标志物[3]。大量研究表明，多个miRNAs 如miR-34a、miR-146b、miR-31、miR-221、miR-21 等 在PTC 中过量表达，与PTC 发生及预后有关[4]。但miR-599 在PTC 中表达水平及与PTC 关系鲜有报道。溴结构域蛋 白4（bromodomain-containing protein 4,BRD4）是BET 家族主要成员之一，在多种疾病的发生、发展中发挥重要作用。研究报道，抑制BRD4 表达可以影响肿瘤细胞生物活性，减缓肿瘤生长[5]。因此，本研究旨在分析miR-599 和BRD4 在PTC 癌变组织中的相对表达量及其与PTC 发生、发展及预后的关系，以期为诊断和治疗PTC，改善患者预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2005年5月—2007年3月云南省第一人民医院接受甲状腺手术的PTC 患者52 例作为研究对象。其中，男性14 例，女38 例；年龄27～45 岁，平均（35.13±7.02）岁；癌旁正常甲状腺组织41 例。根据美国癌症联合委员会癌症分期手册中分化型甲状腺癌TNM 分期标准[6]：Ⅰ期24 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期8 例，Ⅳ期5 例。每例患者切除甲状腺后，立即留取肿瘤组织和癌旁正常甲状腺组织（距肿瘤1 cm 处正常甲状腺组织），置于液氮中冷冻保存。纳入标准：①所有患者符合甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊疗指南中PTC 诊断标准[7]；②病灶＞5 mm；③均行全甲状腺切除手术；④经本院医学伦理委员会批准，所有患者及其家属知情并自愿签署同意书。排除标准：①其他分化型甲状腺癌，如滤泡状癌、未分化癌和髓样癌；②有其他脏器肿瘤；③术前因其他肿瘤进行过放化疗治疗；④有既往颈部手术史。

1.2 试剂与序列

RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、蛋白提取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司，BCA 蛋白浓度检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，BRD4 抗体和GAPDH 抗体购自美国Cell Signaling 公司，ECL 超敏发光液和Western blotting 一抗稀释液购自江苏碧云天生物技术研究所，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-599 正向引物：5'-GUU GUGUCAGUUUAUCAAAC-3'，反向引物：5'-CTCCTAT CGCACTTTAATCTCTAACT-3'；内参U6 snRNA 正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；BRD4正向引物：5'-GTGGGAGGAAAGAAACAGGGACA-3'，反向引物：5'-AGGAGGAGGATTCGGCTGAGG-3'；内参GAPDH 正向引物：5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCA G-3'，反向引物：5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTG-3'。

1.3 方法

1.3.1 RNA 和蛋白提取取液氮中保存的甲状腺肿瘤组织和正常组织，研磨，组织总RNA 和总蛋白的提取采用试剂盒法，纯化后采用分光光度仪（美国贝克曼库尔特有限公司）检测总RNA 浓度和纯度，提取RNA 溶液A260/A280 值＞1.8 可用于后续检测，同时采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测提取纯化后蛋白浓度。

1.3.2 RT-PCR提取总RNA 溶液经稀释后，用于逆转录生成cDNA，以cDNA 为模板进行RT-PCR 检测miR-599 相对表达量，以U6 snRNA 为内参对照，RT-PCR 扩增总体系20 μl，Mix 10 μl，正反向引物各1 μl，模板2 μl，DEPC 水6 μl。RT-PCR 程序：95℃预变性15 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min 循环扩增，共40 个循环。每个样本重复3 次。

1.3.3 Western blotting取蛋白样品，经电泳、转膜、封闭、洗膜后，分别加入BRD 抗体和GAPDH 抗体稀释溶液中，4℃、低速震荡条件下，孵育过夜。取出后用15 ml TBST 冲洗3 次，10 min/次。冲洗后，将膜放于辣根过氧化酶标记的牛抗鼠第二抗体IgG 孵育液中，震荡孵育1 h，取出后用15 ml TBST 冲洗3 次，10 min/次。最后，将膜放入ECL 显影液中，充分接触3～5 min，UVP 凝胶成像仪中曝光、拍照。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验，绘制Kaplan-Meier 生存曲线，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-599、BRD4 在PTC 组织中的表达

癌变组织中miR-599 相对表达量与正常组织中miR-599相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），癌变组织低于正常组织（见表1）；癌变组织中BRD4相对表达量与正常组织中BRD4 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），癌变组织高于正常组织（见表1 和图1）。

2.2 miR-599、BRD4 相对表达量与PTC 临床病理特征的关系

TNM 分期晚的患者miR-599 相对表达量低于分期早的患者（P＜0.05），TNM 分期晚的患者BRD4 相对表达量高于分期早的患者（P＜0.05）；肿瘤直径＞1 cm 患者miR-599 相对表达量低于肿瘤直径≤1 cm 患者（P＜0.05），肿瘤直径＞1 cm 患者BRD4 相对表达量高于肿瘤直径≤1 cm 患者（P＜0.05）；肿瘤侵犯包膜患者miR-599 相对表达量低于肿瘤未侵犯包膜患者（P＜0.05），肿瘤侵犯包膜患者BRD4 相对表达量高于肿瘤未侵犯包膜患者（P＜0.05）；淋巴结转移患者miR-599 相对表达量低于无淋巴结转移患者（P＜0.05），淋巴结转移患者BRD4 相对表达量高于无淋巴结转移患者（P＜0.05）。见表2。

表1 miR-599、BRD4 在癌变组织和正常组织中的相对表达量比较 （±s）

表1 miR-599、BRD4 在癌变组织和正常组织中的相对表达量比较 （±s）

组别 nmiR-599 BRD4癌变组织 52 0.88±0.10 4.57±1.27正常组织 41 3.12±0.84 1.25±0.31 t 值 19.086 18.200 P 值 0.000 0.000

图1 BRD4 蛋白相对表达量

2.3 miR-599、BRD4 相对表达量与预后关系

miR-599 和BRD4 相对表达量以癌变组织中平均表达量值为界，分为高水平和低水平。高水平患者miR-599 和BRD4 与低水平患者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。高水平miR-599 患者5 和10年病死率均低于低水平患者；高水平BRD4 患者5 和10年病死率均高于低水平者。见表3 和图2。

2.4 miR-599、BRD4 相对表达量相关性分析

PTC 癌变组织中miR-599 与BRD4 相对表达量呈负相关（r=-0.872，P=0.000）。见图3。

表2 PTC 临床病理参数与miR-599、BRD4 相对表达量的关系

表3 miR-599、BRD4 相对表达量与预后关系 例（%）

图2 miR-599、BRD4 相对表达量高水平组和低水平组生存曲线

图3 miR-599、BRD4 相对表达量相关性分析

3 讨论

PTC 是甲状腺组织中最常见的恶性肿瘤，受激素、遗传、环境等因素影响，在基因方面，PTC 的特征是通过激活BRAF 和RET/PTC 基因重组中的基因突变而改变RET/PTC-RAS-BRAF 信号传导途径[8]。正常细胞中基因表达受到复杂基因调控网络的高度调控，其调控网络被阻断或异常过量表达则可能引发各种疾病，包括癌症[9]。miRNA 是一类长度约为20～24 个核苷酸的非编码单链小RNA，参与基因转录后表达调控，一个miRNA 可以同时调控多个靶基因，多个miRNA 也可以调控同一个基因[10]。miRNAs 通过干扰蛋白表达，调控细胞增殖、分化和凋亡，通常导致转录抑制或靶基因降解和基因沉默，越来越多的研究表明，miRNAs 异常表达与癌症发生相关，表现出在正常组织和肿瘤组织中表达量不同[11]。戴璇璇等[12]采用基因芯片技术和RNA 印记杂交法检测PTC 甲状腺组织中miRNA 表达水平，结果显示miR-34a、miR-146b、miR-31、miR-221、miR-21 在PTC 甲状腺肿瘤组织中过表达，并提示miR-221 和miR-146 在PTC 预后预测中具有重要作用。SUN 等[13]研究报道，miR-146a 和miR-146b 在甲状腺组织中过量表达与PTC 发生及恶化有关，可能是PTC 潜在的生物标志。PERDAS 等[14]研究发现，let-7 miRNA 能够抑制肿瘤RAS 基因表达，起到抑制肿瘤作用，可作为PTC 的新型诊断、治疗、监测及预后标志物。李桂荣等[15]研究报道，miR-221 和miR-222 在PTC 癌变组织中过表达，与PTC 肿瘤侵犯包膜、局部淋巴结转移等相关，miR-221 和miR-222 对PTC 临床诊断、治疗及预后有指导意义。

目前，miR-599 已被发现在肝细胞癌和乳腺癌中表达下调。TIAN 等[16]研究报道，hsa-miR-599 在肝细胞癌中表达下降，而hsa-miR-599 过表达可通过抑制靶基因MYC 抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，提示hsa-miR-599 可以作为肝细胞癌诊断和治疗的生物标志物。但miR-599 在PTC 中表达尚未见报道。本研究采用RT-PCR 检测PTC 甲状腺癌变组织和癌旁正常组织中miR-599 的相对表达量，miR-599 在PTC癌变组织中相对表达量低于正常组织。miR-599 相对表达量与患者病理特征关系分析结果表明，miR-599相对表达量在PTC 患者TNM 分期、肿瘤直径、肿瘤有无侵犯包膜、淋巴结是否转移方面存在差异，与在肝细胞癌和乳腺癌中表达趋势相同，说明miR-599 相对表达量与PTC 发生、发展相关。miR-599 相对表达量高水平患者5 和10年病死率均显著低于miR-599 相对表达量低水平患者，说明miR-599 相对表达量影响患者预后。

BRD4 是BET 家族成员，可以通过结合乙酰化组蛋白而影响下游基因转录，加快肿瘤细胞生长，许多研究已证实，BRD4 抑制剂可以导致癌细胞周期停滞或凋亡，是癌症治疗的新靶点[17-18]。有研究报道，BRD4 在膀胱癌病变组织中过量表达，通过上调C-myc 正向调节EZH2，促进癌细胞增殖，而抑制BRD4 能够减少癌细胞增殖，同时促进癌细胞凋亡，提示BRD4 是一种干扰转录程序治疗癌症的新型药理治疗靶点。在小细胞肺癌中BRD4 有同样的表达趋势[19]。在甲状腺癌中，GAO 等[20]研究报道，BRD4 在甲状腺癌组织和细胞系中上调，而抑制BRD4 表达可导致癌细胞周期停滞，增强患者碘摄取进而抑制肿瘤生长。本研究结果，BRD4 在PTC 癌变组织中相对表达量高于正常组织，BRD4 相对表达量在PTC 患者TNM 分期、肿瘤直径、肿瘤有无侵犯包膜、淋巴结是否转移有差异，且BRD4相对表达量高水平患者5 和10年病死率高于BRD4 相对表达量低水平患者，与GAO 等研究趋势一样，说明BRD4 与PTC 发生、发展及预后密切相关。WANG 等[21]研究报道，hsa-miR-599 在乳腺癌中通过下调BRD4 抑制乳腺癌细胞增殖、生长。本研究对PTC 癌变组织中miR-599 和BRD4 相对表达量的相关性分析结果，PTC癌变组织中miR-599 和BRD4 相对表达量呈负相关，说明miR-599 和BRD4 在PTC 中也可能存在相互作用关系。

综上所述，miR-599 在PTC 癌变组织中下调，BRD4 在PTC 癌变组织中上调，可能参与PTC 患者癌细胞增殖、分化、转移，影响患者预后，可作为临床诊断、治疗PTC，预测患者预后的靶基因。本研究初步分析miR-599 和BRD4 在PTC 癌变组织中的相对表达趋势，而对其作用机制尚不完全清楚，因此需进一步研究miR-599 和BRD4 影响PTC 患者临床病理特征及对PTC 癌细胞生物活性的作用机制。