基于网络药理学方法的左金丸治疗结直肠癌的作用机制分析＊

潘秋莎，杨梦蝶，呼雪庆，赵 明,2，苏式兵＊＊

（1.上海中医药大学交叉科学研究院 上海 201203；2.AntiCancer,Inc.圣地亚哥 92111）

左金丸，又名“萸连丸”。首载于《丹溪心法》,为金元著名医家朱丹溪所创，方中重用苦寒之黄连为君,佐以辛热之吴茱萸,清泄肝火,降逆止呕。左金丸药理学研究表明其在溃疡性结肠炎、胃粘膜损伤中良好的效果[1]。近年来有研究表明左金丸在结直肠癌的治疗和研究中有突出的表现，其单体成分小檗碱、吴茱萸碱和槲皮素等更是在结直肠癌（colorectal cancer,CRC）的实验研究中有明显抑制肿瘤细胞的生长和增殖，促进肿瘤细胞凋亡、抑制癌基因表达等作用[2]。

网络药理学从系统生物学的角度出发,融合了多向药理学的思想，结合计算机技术，通过构建生物分子网络，分析和预测中药及复方治疗疾病中多成分、多靶点及多途径的机制研究[3,4]。利用中药靶标及药理活性预测，通过建立药物-靶点-疾病之间的相互关系进行分析，可以揭示药物作用于人体的效应机制[5,6]。本研究通过多种公共数据平台，运用网络药理学的分析方法，获取左金丸和结直肠癌的相关信息。构建左金丸作用于结直肠癌的成分-靶点-疾病的网络结构，揭示左金丸治疗结直肠癌的潜在作用机制，并为左金丸的临床应用提供理论依据，为中药及中药复方的药理作用、效应机制提供新的研究思路和方法。

1 材料与方法

1.1 左金丸活性成分及靶点筛选

本研究依托中药综合数据库分析平台TCMSPlsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php[7]；HIT（http://lifecenter.sgst.cn/hit）[8]；TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid）[9]；TCMdatabase@taiwan（tcm.cmu.edu.tw）[10]，检索收集左金丸中黄连、吴茱萸的化学成分，按照口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%和化合物类药性(Druglikeness，DL)≥0.18进行筛选，得到即为左金丸的的活性成分。OB是指药物分子通过口服的方式进入人体循环系统能力的重要参数，同时也是作为药物筛选过程及分子类药性的一个重要指标[11]；DL的阈值筛选通常用于药物研发中，可将高质量的先导化合物从大量的化合物分子库中筛选出进而提高药物设计的精准率[12]。 通 过 数 据 库 TCMSP、Drugbank（http://www.drugbank.ca）[13]检索活性成分对应的人类靶蛋白，通过该数据库 SIB（http://www.swisstargetprediction.ch）[14]、SEA（http://sea.bkslab.org/）[15]进行化学结构相似性扩展,筛选相对应的人类靶蛋白。将以上得到的靶点合并去重，删掉无对应的靶点及成分。通过软件Cytoscape 6.1（http://www.cytoscape.org）[16]构建左金丸成分-靶点网络，按照大于Degree平均值为卡值，进一步构建左金丸的核心成分-靶点网络。

1.2 结直肠癌疾病靶点收集

数据库DisGeNET（www.disgenet.org）[17];OMIM（http://www.omim.org）[18]；OUGene（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/OUGene）[19]等涵盖了人类遗传疾病信息及治疗疾病的药物信息，通过疾病名称或症状关键词搜索可获得疾病或症状的靶点信息，检索提取其相关的靶基因。

1.3 构建左金丸治疗结直肠癌的功能靶点

将预测所得的左金丸靶点蛋白及结直肠癌靶基因相互交集，与预测所得的核心靶点，合并去重后得到的靶点导入String数据库（https://string-db.org/Version10.5）[20],获得蛋白互作关系，构建PPI网络,将数据保存为TSV格式。将文件中node1、node2和Combined score信息导入Cytoscape6.1中。Cytoscape是一个开放源码的生物信息分析软件。通过其Network Analyzer功能分析，以大于中介中心（Betweenness）和节点介度（Degree）平均值为卡值，对上述的数据进行分析，构建左金丸作用于结直肠癌的功能靶点网络。

节点介度，又称为连通性，是一个基因拥有边（调控关系）的数量，网络结构中节点（note）的大小与度成正比关系，节点越大，表示与此节点相连的边越多，即与这个基因的关联性更大[21]。中介中心，是一个结点担任其它两个结点之间最短路的桥梁的次数，反映在网络中某一节点与其他节点之间的接近程度。通常以最短路径数量计算，设节点s和节点t，用d(s,t)表示节点s到节点t的距离,δst表示节点s到节点t的最短路径数量δst（v）表示节点s到节点t的最短路径中经过节点v的数量，所以经过v点的路径数量为:∑δst(μ)/δst[22]。

1.4 构建左金丸治疗结直肠癌的成分-靶点-通路网络

利用在线工具 Davaid6.7（https://david.ncifcrf.gov）[23]对筛选所得的核心靶点进行基因本体GO生物学功能富集分析和KEGG通路富集分析。所得值按按Bonferroni法校正后，P＜0.01筛选。为了能直观阐述左金丸治疗结直肠癌的作用机制，选取P值排名前二十的通路信息构建左金丸的活性成分-靶点-通路的网络结构。分析其网络拓扑参数结构，构建左金丸部分成分-靶点-通路图，阐释左金丸作用于结直肠癌的作用机制。

2 结果

2.1 左金丸活性成分及其靶点的筛选

经过对左金丸化学成分收集，得到234种化合物，其中黄连62种、吴茱萸172种。筛选后得共41种活性成分,黄连15种,吴茱萸26种,主要有槲皮素、β淄谷醇、异鼠李素、吴茱萸碱、小檗碱等。其共有成分包括了小檗 碱（Berberine）、槲 皮 素（Quercetin）及 黄 柏 酮（Obacunone）3种。

在TCMSP、Drugbank中查找41个成分对应的人类靶蛋白，得到靶蛋白360个。其中黄连162个，吴茱萸198个。通过SEA和SIB数据库，对活性成分进行成分相似性扩展靶点预测，得到281个靶点，全部合并去重后得到482个靶点，其中黄连共有224个，吴茱萸有262个，删除无靶点对应的成分，得到36个活性成分。运用软件Cytoscape6.1构建左金丸成分-靶点网络（图1A）。该网络结构共有610条边，共522个节点，结构平均节点度为3.86，其中有36个节点为左金丸的活性核心成分。进一步，结构建核心成分-靶点网络，按照中介中心度（Betweenness）和节点介度（Degree）平均值筛选，得到72个核心靶点，构建左金丸的核心成分-靶点网络（表1，图1B）。

2.2 结直肠癌的疾病基因

在数据库 GENenNET、OMIM、OUGene中输入“colorectal cancer”查找与其有关的基因蛋白信息，收集合并得到737个靶基因。

图1 左金丸成分-靶点网络

2.3 构建左金丸治疗结直肠癌的功能靶点网络

将上述左金丸预测所得482个靶点与结直肠癌的737疾病基因，通过维恩分析得到共有靶点58个（图2A）。将其与预测分析所得核心靶点合并去重后得到120个靶点蛋白，通过数据库String，分析蛋白之间的相互关系，构建PPI网络。再通过Cytoscape6.1对所得数据进一步分析，选取大于中介中心（Betweenness）和节点介度（Degree）的平均值，得到50个靶点蛋白，即为左金丸作用于结直肠癌的功能靶点。构建左金丸治疗结直肠癌的潜在功能靶点网络（图2B），网络中节点越大，其Degree值越高，意味着与结直肠癌的关系更为密切。排名靠前涉及靶点有PIK3CA、AKT1、TP53、HIF-1α、BAX、MYC、CCND1、EGFR、STAT3、MMP9等。

表1 左金丸活性成分

2.4 左金丸作用于结直肠癌的成分-功能靶点-通路网络

利用平台Davaid6.8对左金丸治疗结直肠癌的潜在功能靶点进行基因功能及通路分析。得到基因GO本体条目283条，涉及核质、细胞凋亡、基因表达调控等方面，基因百科全书（KEGG）通路58条，将P值排名前二十的功能信息展示（表2）。结果显示：左金丸的活性成分主要富集在细胞增殖正调节、凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化正调控、细胞迁移正调控、RNA聚合酶II启动子转录的调控等生物过程；细胞组成方面主要富集在细胞质、核质等方面；分子功能主要涉及了蛋白质结合、蛋白激酶结合及转录因子结合等。其通路主要富集在癌症途径、乙型肝炎、癌症中的蛋白多糖、HIF-1信号通路、PI3K-AKT信号通路、HTLV-1感染通路、结直肠癌、胶质瘤、FoXO信号通路等。通过Cytoscape6.1构建左金丸成分-作用靶点-通路网络（图2C）。

2.5 左金丸部分成分-靶点-通路分析

构建左金丸治疗结直肠癌的成分靶点通路，结合文献将预测所得左金丸作用于结直肠癌的功能靶点，及其对应的成分、通路通过示意图综合展示（图3）。如图所示，图中绿色箭头表示促进作用，红色的T线表示抑制作用，黄色的圆形表示左金丸作用于结直肠癌

的作用靶点，绿色圆形表示通路的靶点，蓝色箭头表示靶点对应的成分，白色框内表示相关通路。

表2 显著富集前二十条生物过程和KEGG(Р＜0.01)

图3 左金丸治疗结直肠癌的部分功能靶点通路

实验研究表明，左金丸抗肿瘤的机制是多成分、多靶点、多途径作用的。研究观察槲皮素对结肠癌细胞系RKO影响，发现其可通过上调P21和P27的表达使细胞周期阻滞与G0/G1期，上调凋亡蛋白p53，诱导RKO细胞发生凋亡[24]；使用槲皮素处理人结肠癌细胞SW480，结果表明其可以明显抑制细胞中Bcl-2，C-myc的表达水平，进而抑制了肿瘤细胞的的侵袭和转移[25,26]。因而，在不同的细胞中，槲皮素的作用机制及途径各不相同，但主要是通过下调癌症相关基因，上调抗癌基因从而诱导细胞发生凋亡。β淄谷醇具有抗肿瘤活性，但其与结直肠癌之间的研究甚微，有研究发现β-淄谷醇能抑制人结肠腺癌细胞COLO320中βcatenin蛋白及细胞增殖抗原PCNA的表达，进而诱导肿瘤细胞发生凋亡[27]。吴茱萸碱可通过降低缺氧诱导因子HIF-1α的及Akt1/2的蛋白水平，抑制PI3K/Akt的信号传导，进而抑制人结肠癌LOVO细胞的增殖和转移[28]；此外，赵[29]等人探索吴茱萸碱对人结肠癌细胞HCT-116增殖和迁移的影响，检测到随着时间和药物浓度的增加，吴茱萸碱通过下调CyclinA1的表达，激活P53信号通路和Caspase-3促进细胞发生凋亡，且抑制细胞内的磷酸葡萄糖异构酶（Glucose Phospho Isomerase，PGI）介导的JAK2/STAT3信号通路的激活，降低MMP-3的表达实现细胞迁移抑制作用。由此可见，吴茱萸碱在抗结直肠癌中主要表现为诱导细胞发生凋亡，抑制肿瘤细胞迁移等作用。研究表明小檗碱能促进肠癌细胞HCT116及SW480中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的表达，通过靶向激活MAPK信号通路从而抑制了AOM/DSS诱导形成的肠癌[30]。检测异鼠李素对LOVO细胞的增殖凋亡影响，发现其可抑制EGFR磷酸化，提高BAX的表达水平，降低Bcl-2的表达水平进而实现诱导细胞凋亡[31]。结合以上文献及预测结果分析，本研究认为左金丸主要活性成分在作用于结直肠癌中的靶点分别如下：槲皮素主要对应靶点有 P53、bcl-2、bax[32]等；异鼠李素主要对应靶点TNFR、EGFR等；吴茱萸碱主要主要对应靶点有HIF-1α、PI3K、AKT、P53及Bax[33]、NF-κB及VEGFA[34]等；β淄谷醇主要对应到靶点β-catenin等；小檗碱对应的靶点有HSP90、p53、Fas等；异鼠李素对应的靶点有EGFR、BAX、Bcl-2等。

3 讨论

结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，病变部位主要侵及结直肠。据2018年国家癌症数据中心统计报告显示：结直肠癌男性发病率位居第四，女性第三，死亡率均占第四。

左金丸中活性成分槲皮素、吴茱萸碱及小檗碱在结直肠癌的治疗研究中报道相对较多，药理学研究显示槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及抗炎的作用[35]，可通过P53等信号通路抑制肿瘤细胞增生，进而诱导细胞发生凋亡。研究表明吴茱萸碱除了抗炎镇痛，抗病原微生物的作用外，还能增强机体的抗缺氧能力[36]，在结直肠癌的治疗机制研究中主要涉及抑制细胞的增殖和周期、促进凋亡及自噬、抑制肿瘤血管新生等方面，其涉及的相关通路主要有PI3K-AKT、JAKSTAT等[37]。小檗碱具有抗炎、杀菌作用，另外研究也表明其也具有抗肿瘤、降血糖等作用，在结直肠癌中的研究主要涉及抑制肿瘤细胞增生、诱导细胞凋亡等方面[38]。

据已有文献报道显示：在实体瘤中，慢性缺氧环境能促进肿瘤细胞的增殖迁移及侵袭能力，而细胞上皮间质化是细胞丧失上皮表型转为间质化细胞进而产生肿瘤原位浸润及远处转移的重要因素之一。缺氧环境下，胞内的HIF-1α表达升高，而与上皮间质转化相关蛋白钙黏附蛋白表达下调，PI3K/Akt信号通路下游信号分子AKT1及ATM激酶磷酸化水平上调，HIF-1的主要靶基因是血管内皮生长因子（VEGF），它在肿瘤细胞中参与肿瘤细胞的新生，能使细胞耐受缺氧环境，促进肿瘤生长，因此HIF-1通路的活化是结直肠癌发生的一个重要机制之一[39]。研究表明炎症在结直肠癌的发病中是一个至关重要的因素，慢性肠道炎症对肠道持续性的刺激会使肠道上皮细胞持续性活化，进而使得细胞或血管异常增生。研究发现结直肠癌中有过度活化的STAT3异常表达，其可诱导SOCS3基因甲基化，进而导致STAT3通路失衡、持续活化。STAT3是IL-6的活化因子，而IL-6与结直肠的发病密切相关，STAT3在结直肠癌的发生中起着不可忽视的作用[40]。P53是抑癌基因，其突变是肿瘤发生的一个关键因素，在P53和结直肠癌的相关的通路中多表现与促细胞凋亡相关[41]。由此可见，左金丸在治疗结直肠癌中涉及到相关的靶点主要与促进细胞凋亡、抑制炎症、抑制细胞和血管增生密切相关。

在本研究预测结果中显示富集通路FoXO信号通路，目前在结直肠癌的研究中，尚未见到左金丸及其活性成分与FoXO通路直接相关的的研究报道。其转录因子FoxO1中的苏氨酸、丝氨酸以及赖氨酸残基的磷酸化修饰能使其穿梭于细胞核内外,最终导致FoxO1转录活性的改变，进而参与细胞的增殖、凋亡、分化和抵抗氧化应激等[42]，但其在结直肠癌的发展中起着何种作用仍需要实验验证。

4 结论

本研究通过分析得到左金丸核心成分36种，其排名靠前且与结直肠癌密切相关的有槲皮素、小檗碱、吴茱萸碱等；50个潜在功能靶点，主要功能靶点涉及PIK3CA、TP53、HIF-1α、STAT3等；283条GO生物功能及58条KEGG，其中与HIF-1、PI3K-AKT等信号通路密切相关。根据相关文献及预测分析结合表明：左金丸作用于结直肠癌潜在的机制可概括为：①调节机体免疫耐受能力，增强宿主免疫抵抗，抑制炎症对肠粘膜的持续性刺激，进而阻止了细胞的异常增生；②通过上调抑癌基因，下调癌症相关因子，促进肿瘤细胞发生凋亡；③降低肿瘤细胞的耐受缺氧环境，促进细胞细胞发生凋亡及上皮间质的转移。

网络药理学的研究方法为中药方剂效应机制的研究提供了新的研究方法，也为中医经典名方的实验研究及临床应用提供了进一步的理论依据和研究思路。但是，由于研究依托公共数据平台，难以获得完整、准确和及时的数据，且缺乏网络药理的量化分析技术，这些是目前网络药理学研究的局限。其次，中医在临床上讲究辨证论治，处方更是需要辩证施治，本研究尚未对复方配伍中的剂量关系层次进行探讨。因此，网络药理学的预测结果有待进一步验证。